[发明专利]一种基于磁性纳米微粒的人胸苷激酶荧光免疫分析新方法

权利要求书

1.一种基于磁性纳米微粒的人胸苷激酶荧光免疫分析新方法，其特征在于，hTK1包被的核壳型磁性颗粒(hTK1-MP)的制备包括以下步骤：

1)磁性纳米颗粒的制备：采用液相共沉淀方法，分别将一定浓度的FeCl₃·H₂O和FeCl₂·4H₂O在氨性溶液中共沉淀，静止分层并去掉上层清液后，立即加入浓度为20-30％的四甲基氢氧化铵溶液，再用超声法分散后，再用砂漏斗过滤，除去其中较大的磁性纳米颗粒，即可得到颜色为灰褐色、且磁性纳米颗粒大小均匀一致的溶液；

2)磁性纳米颗粒的氨基硅烷化：吸取一定剂量的磁性纳米颗粒溶液、并加入至在100-200ml异丙醇溶液中；用超声法将磁性纳米颗粒进行分散；同时，边搅拌边加入3-6g聚乙二醇(PEG-4000)，继续搅拌10-20min后加入适量蒸馏水，然后加入0.1-0.3ml正硅酸乙酯(TESO)水解形成硅壳层；在特定磁场作用下，用无水乙醇和蒸馏水分别洗涤干净后，分散于无水乙醇中；再加入适量蒸馏水后，在不断搅拌下加入0.1-0.3ml 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)，形成氨基化硅烷壳层；在特定磁场作用下，分别用无水乙醇和蒸馏水洗涤干净后，分散于pH7.0-7.6的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，所得物质即为氨基硅烷化的磁性纳米颗粒(MNPs)；

3)磁性纳米颗粒标记人类I型胸苷激酶(hTK1)：将上述氨基硅烷化的磁性纳米颗粒(MNPs)用戊二醛活化，用pH7.0-7.6的磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤干净后，再分散于相同的PBS中；然后，直接在此PBS溶液中加入一定剂量的hTK1(用基因克隆技术，在大肠杆菌中表达hTK1基因，制备得到hTK1的融合蛋白)，在一定条件下反应0.5-1.5h，即可将hTK1共价固定于MNPs上，得到hTK1包被的磁性纳米颗粒(hTK1-MNPs)；

4)封闭：在hTK1-MP分散溶液中加入甘氨酸溶液反应1h，即可封闭磁性纳米颗粒表面的活性醛基；最后，用pH7.0-7.6的磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤干净后，再分散于相同的PBS中；

5)保存：将hTK1-MNPs保存在4℃的冰箱中备用。

2.一种基于磁性纳米微粒的人胸苷激酶荧光免疫分析新方法，其特征在于，hTK1酶催化荧光检测包括以下步骤：

采用竞争免疫分析方法，将待测hTK1与辣根过氧化物酶标记的hTK1单克隆抗体(HRP-Ab)反应30-60min，再加入同体积的hTK1-MP，在37℃下竞争反应30-60min，用pH7.0-7.6的磷酸盐缓冲溶液洗涤干净后，在特定磁场作用下分离，并分散于pH7.0-7.6磷酸盐缓冲溶液中，加入一定浓度的对羟基苯丙酸(HPPA)、过氧化氢(H₂O₂)和磷酸盐缓冲溶液，反应0.5-1h，在特定磁场作用下分层；移取上层清液、并置于荧光比色皿中，用紫外光激发，测量可见光处的荧光强度；测试溶液的荧光强度随着试样中的hTK1的浓度增加而减弱，荧光响应与hTK1在0.01-1ng/ml之间成线性关系，从而实现对hTK1的准确测定，其检测下限可达到0.008ng/ml；通常情况下，由于恶性肿瘤(乳癌)等血清样品中的hTK1浓度约为ng/ml水平，所以，采用此灵敏度高的方法可以进行人体血清中hTK1浓度的测定。