[发明专利]溶藻弧菌外膜蛋白Pal(VA1061)的表达和作为疫苗组份的应用

说明书

技术领域

本发明涉及溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)表达的一种外膜蛋白(outermembrane protein，OM protein)Pal(VA1061)的免疫调节功能。

背景技术

溶藻弧菌广泛分布于世界各地海水及河口处，并且数量居海水类弧菌之首，对于溶藻弧菌致病微生物，研究的重点就是免疫学分析，阐明其致病机理并找出有效的防治方法，防治的办法主要包括药物即抗生素防治以及免疫防治，其中抗生素虽然在最初的使用中取得了巨大的进展，然而随着抗生素的广泛使用，也出现了一系列的相关问题，一方面抗生素的不合理使用，增加抗生素耐药菌的产生，细菌感染增多；另一方面，因抗生素的耐药性而人为地加大剂量，加剧耐药性的产生。因此，研制以具有免疫保护作用的高效中和抗原为成分的疫苗具有广阔的应用前景。

在各种动物疾病的防治中，疫苗的使用是一个具有低成本、高效的方法，并且已经有部分疫苗得到大规模使用并取得了不错的防治效果。疫苗种类很多，以细菌为例，包括全菌疫苗、亚单位疫苗以及DNA疫苗等。从实际应用的情况来看，全菌疫苗虽然具有制作相对简单而且成本也较低的优点，但它也存在不少由于使用全菌体而固有的一些缺点。如减毒全菌疫苗可能出现菌株突变而导致的毒性恢复等不良后果；灭活全菌疫苗则往往由于对细菌的灭活过程而导致一些免疫保护基团活性的改变，而影响免疫保护的效果。而且对全菌疫苗来说，由于细菌成分的复杂性，其中往往存在一些毒性成分(如LPS等)，会导致机体产生不良反应。并且常规制得的全菌疫苗免疫保护效果不理想。然而，全菌疫苗仍然是目前最为主要的疫苗种类。其原因可能与高效中和抗原的发现和鉴定困难有关。

随着基因组学、蛋白质组学和转录分布图技术的发展，这就为细菌疫苗提供了新的契机。基因工程疫苗由于具有高效，且摆脱了传统疫苗的种种缺点，成为疫苗研究的重点，具有广阔的应用与开发前景。外膜蛋白是革兰氏阴性菌外膜的主要成分之一，由于外膜蛋白直接面对宿主的体液及组织，细菌利用外膜蛋白进行黏附、侵入和炎症等生理活动，更容易被宿主识别作为攻击目标，使得革兰氏阴性菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性，不仅可以刺激体液免疫，而且对细胞免疫亦有刺激作用。近年来，细菌的一些外膜蛋白已经被证实具有良好的免疫原性，用其制备基因工程疫苗具有良好的前景。如在大肠杆菌中发现外膜蛋白OmpX的免疫保护功能。但在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的溶藻弧菌外膜蛋白Pal(VA1061)的免疫调节功能。

本专利率先采用分子克隆和免疫学等现代生物学技术，以溶藻弧菌为研究对象，对外膜蛋白基因Pal(VA1061)进行克隆、表达和纯化，并在此基础上深入研究其免疫保护性。免疫和攻毒实验结果表明溶藻弧菌的外膜蛋白Pal(VA1061)显示出对溶藻弧菌较高的免疫保护作用。其相对免疫保护率(RPS)为93.7％，此外还显示出对荧光假单胞菌的交叉免疫原性，其免疫保护率(RPS)达到63.2％。这些结果说明Pal可作为疫苗组分。

发明内容

外膜蛋白具有良好的免疫原性，对细胞免疫和体液免疫均有刺激作用。本发明涉及通过对表达的溶藻弧菌外膜蛋白Pal(VA1061)免疫保护性以及免疫交叉性的分析，发现免疫鲫鱼后可以显著提高对重要致病菌溶藻弧菌以及荧光假单胞菌的抵制力。初步评价其作为候选疫苗的可行性，对水产疾病的防治具有重要意义。

附图说明：

图1.Pal(VA1061)基因PCR产物0.8％琼脂糖凝胶电泳分析

图2.pET-28a-Pal重组子的双酶切鉴定

图3.克隆子BL21-pET-28a-Pal在E.coli-BL21中的诱导表达

图4.SDS-PAGE回收包涵体中的重组蛋白.lane 1：包涵体超声破碎上清；lane 2：SDS-PAGE切胶纯化蛋白

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(2001 by Cold SpringHarbor Laboratory Press)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

溶藻弧菌外膜蛋白Pal(VA1061)基因的克隆和鉴定

1.溶藻弧菌Pal(VA1061)基因的扩增