[发明专利]一种具有抗肿瘤活性的针层孔菌多糖Ⅱ及其提取分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及针层孔菌多糖技术领域，特别是涉及具有抗肿瘤活性的针层孔菌多糖II及其提取分离方法。

背景技术

进入21世纪以来，癌症已成为人类健康的头号杀手。据统计，我国每年新增癌症患者近200万人，每年因癌症死亡约150万人，而癌症的发病率还在以每年2.5％的速度不断增加。国际癌症研究中心(IARC)2005年10月公布的一份研究报告中指出：根据目前癌症的发病趋势，到2020年全世界癌症发病率将比现在增加50％，全球每年新增癌症患者人数将达到1500万人，可见开发高效低毒的抗肿瘤药物已刻不容缓。目前用于癌症治疗的化学药物存在许多缺陷：1、药物在作用于靶细胞的同时往往也对正常细胞具有毒性，使病人出现水肿、消瘦、乏力、白细胞数下降、肝功能不良等严重的副作用；2、大多数药物都有不同程度的致突变遗传毒性，为此治疗肿瘤的同时增加了病人患第二种肿瘤的可能性。近年来中草药治疗癌症研究不断深入，由于其具有较低的毒副作用、无致突变性以及在增强机体自身对癌细胞的免疫以及促进癌细胞凋亡两方面独特的疗效，越来越引起人们的关注。

针层孔菌最早以“桑黄”名称被记载于《神农本草经》、《本草纲目》等药典，具有清热、滋阴、收敛、止血功效，可治血崩、血淋、脱肛泻血、带下、经闭、瘰疬溃疡、脾虚泄泻等。桑黄非某种真菌，而是针层孔菌属(Phellinus)的一类子实体。目前常用的种名有3个：火木针层孔菌(P.igniarius)、裂蹄针层孔菌(P.linteus)及鲍氏针层孔菌(P.baumii)。自1968年日本学者Ikekawa T报道桑黄的热水提取物对移植小鼠皮下的肿瘤S180抑制率高达96.7％而对正常细胞没有毒性，它已成为药用真菌研究的一个热点。各国学者特别是中国、韩国、日本等国学者对其进行了大量研究，已证实桑黄具有抗肿瘤、免疫调节、降血糖等作用，它的活性成分主要有多糖、黄酮、萜类，其中研究最多的是桑黄多糖。

目前，桑黄多糖的提取主要是先将各种单体化学成分分离纯化，再进行活性测试，这样的提取方法使得提取分离工作中的盲目性很大，而且在分离过程中也容易造成活性成分的丢失。另，针层孔菌属具有多种不同形状和种名的针层孔菌，其提取到的桑黄多糖也不一定具有活性作用，即具有抗肿瘤活性。

本发明的针层孔菌(P.sp.)是针层孔菌属中的一种(参见图10)，暂未定种名，其核糖体rDNA基因转录间隔序列(ITS1-5.8S-ITS2全长序列)已递交至GenBank，其登录号为EU787449。其子实体多年生，无柄，单生，硬木质，蹄形或半圆形，初期有微细绒毛，后变光滑，不规则龟裂，灰白色、灰黄褐色至灰黑色，具同心环沟，长10-15cm，宽5-8.5cm，厚7-11cm；菌盖顶端具黑色硬皮壳，边缘钝。菌肉锈褐色或咖啡色，硬木质，厚4-8cm。菌管与菌肉色相似，或比菌肉稍浅，多层，每层厚3-6cm；管口与菌管同色，小，圆形；菌肉和菌管组织在氢氧化钾试剂中变黑。二型菌丝系统：生殖菌丝透明，薄壁，直径为2-2.5μm，无锁状联合；骨骼菌丝黄褐色至锈褐色，厚壁，直径为2-4μm。子实层中有刚毛，锥形，黄褐色，厚壁，22-31×6-9μm。孢子近球形至广椭圆形，黄褐色至锈褐色，光滑，4-6×4-5μm，在Melzer试剂及棉兰试剂中无变色反应。该登录号为EU787449的针层孔菌可在野外采集到，市场上也有销售，例如在广州清平药材市场、广州同仁堂等有售。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一是解决现有针层孔菌多糖提取分离方法的盲目性，减少活性成分的丢失，针对GenBank，其登录号为EU787449的针层孔菌(P.sp.)提供一种采用活性跟踪分离方法分离纯化具有抗肿瘤作用的针层孔菌(P.sp.)多糖II的方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：

本发明针层孔菌多糖II的提取分离方法，所述针层孔菌的GenBank登录号为EU787449，该方法包括如下步骤：

a、粗多糖的提取：取针层孔菌子实体，粉碎，加水煮沸提取，提取液浓缩后加入乙醇，置于低温冰箱内，静置5-20小时，离心分离，沉淀在低温干燥即得粗多糖；

b、针层孔菌多糖的分离：取粗多糖，溶于pH值为4～5的醋酸-醋酸钠缓冲液中，离心，过滤，滤液上离子交换柱，用pH值为4～5的醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱1～3个柱体积，洗脱液弃去，然后再用pH值为4～5的含NaCl浓度≥0.2mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱1～3个柱体积，洗脱液经透析除盐后浓缩，在低温干燥，即得多糖II。