[发明专利]一种筛选镇痛中药活性成分的细胞膜色谱法

权利要求书

1、 一种筛选镇痛中药活性成分的细胞膜色谱法，其特征在于包括如下步骤：

(1)白芷醇提液指纹图谱的建立：称取20g白芷药材，加入160ml 95％乙醇，回流提取1～2h，挥干乙醇，残渣用甲醇溶解定容至20ml，从中取250μl用甲醇稀释至7.5ml，过0.45μm微孔滤膜，得到滤液即为白芷醇提液；吸取滤液20μl，采用高效液相色谱方法进行测定，得到白芷醇提液有效成分群指纹图谱，确定13个共有指纹峰；

所述高效液相色谱分析条件：以甲醇-水为流动相系统，柱温30℃，进样量20μl，波长254nm，长度为250mm、直径为4.6mm的Lichrospher5-C18色谱柱，流动相梯度：0～5min，5％～20％甲醇；5～15min，20％甲醇；15～20min，20％～70％甲醇；20～30min，70％甲醇；30～40min，70％～90％甲醇；上述均为体积百分比；

所述白芷醇提液指纹图谱的13个共有指纹峰各相对保留时间分别为：

1号峰：0.031～0.034； 2号峰：0.086～0.088；3号峰：0.607～0.649；

4号峰：0.658～0.665； 5号峰：0.704～0.708；6号峰：0.730～0.739；

7号峰：0.749～0.755； 8号峰：0.810～0.816；9号峰：0.842～0.847；

10号峰：0.856～0.861；11号峰：1；          12号峰：1.085～1.087；

13号峰：1.181～1.186；

各共有指纹峰相对峰面积范围分别为：

1号峰：0.005～0.061； 2号峰：0.016～0.132；3号峰：0.050～0.366；

4号峰：0.010～0.135； 5号峰：0.03～0.148； 6号峰：0.006～0.153；

7号峰：0.086～0.328； 8号峰：0.047～0.105；9号峰：0.018～0.059；

10号峰：0.030～0.113；11号峰：1；          12号峰：0.251～0.492；

13号峰：0.304～0.845；

以上均以11号峰为参照；

(2)输精管平滑肌细胞的原代培养及传代培养：取成年雄性小鼠或成年雄性兔的输精管，剥离内外膜组织，采取酶消化法在培养瓶中培养细胞；当细胞长满覆盖瓶底面积80％左右时，进行传代；

(3)效应成分的结合与解离：将经3～10代传代的细胞消化得到的细胞悬液与步骤(1)获得的白芷醇提液等体积混合均匀，36～38℃温育0.5～24h后，离心去上清，用DMEM培养液洗涤细胞3～5次，得到均匀悬液，离心，弃上清液，得沉淀细胞；在沉淀细胞中加入pH2～6的PBS使细胞变性，离心，收集上清液并挥干，得解离物；

(4)高效液相色谱测定结合前后图谱变化：将步骤(3)所得解离物用甲醇溶解，用高效液相色谱分析，所述高效液相色谱分析条件与步骤(1)的色谱分析条件相同；通过比较解离物指纹图谱和白芷醇提液指纹图谱中各吸收峰的变化，并分别用阿片受体拮抗剂和阿片受体激动剂作参比，确定白芷是否与阿片受体结合；与阿片受体特异结合的特征峰为7号峰、8号峰和10号峰；筛选出的白芷镇痛活性成分为7号峰、8号峰和10号峰；所述阿片受体拮抗剂为盐酸纳洛酮，所述阿片受体激动剂为盐酸哌替啶。

2、 根据权利要求1所述的一种筛选镇痛中药活性成分的细胞膜色谱法，其特征在于：所述与阿片受体特异结合的特征峰7号峰、8号峰和10号峰三个特征峰是与阿片受体结合的活性成分群。

3、 根据权利要求1所述的一种筛选镇痛中药活性成分的细胞膜色谱法，其特征在于：所述7号峰、8号峰、10号峰所代表物质作用位点与纳络酮相同，可被其拮抗；所述7号峰所代表物质作用位点与盐酸哌替啶不同；所述8号峰、10号峰所代表物质作用位点与盐酸哌替啶相同。

4、 根据权利要求1所述的一种筛选镇痛中药活性成分的细胞膜色谱法，其特征在于：所述筛选出的白芷镇痛活性成分对阿片受体有选择性，且只特异性的结合阿片受体κ亚型，而与δ亚型无关。