[发明专利]检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及检测血清或肺脏、肝脏、肾脏、淋巴结等组织样品中的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株存在的试剂盒，特别是涉及以实时荧光定量聚合酶链反应技术早期、快速诊断猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株感染的试剂盒。

背景技术

猪繁殖与呼吸系统综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种高度接触性传染病，以引起母猪繁殖障碍、仔猪和肥育猪呼吸道症状为主要特征。该病在全世界范围内大规模的流行，给养猪业造成了极大的经济损失。2006年夏季，我国中南部爆发了高致病性猪蓝耳病，之后蔓延到全国各个省市。其病原已确定是Nsp2基因发生连续缺失的高致病性猪蓝耳病病毒变异株。高致病性猪蓝耳病能使各种年龄、各种品种的猪都感染发病，且发病率高、病死率高、治愈率较低。2007年，全国共有26个省份发生了高致病性猪蓝耳病，发病猪数量达30多万头。直至今日，疫病形势依然严峻，严重地影响了我国畜牧业生产。因此，为了监测和控制高致病性猪蓝耳病的感染，研究高致病性猪蓝耳病毒变异株的快速检测方法具有重要意义。

PRRSV传统的检测方法主要是病毒的分离培养鉴定，虽然该方法具有一定的特异性和敏感性，但是PRRSV培养的条件苛刻，一般实验室难以实现，同时操作繁琐且耗时长，不利于对大规模样品进行检测。免疫学检测PRRSV的方法主要有酶联免疫吸附试验、间接荧光抗体试验等，但都有敏感性低或特异性较差的问题。此外，上述的这些检测方法还存在着无法区分普通PRRSV和现时国内流行的高致病性PRRSV变异株的局限性。由于高致病性猪蓝耳病发病率高、病程进展快、病死率高，传统的检测方法有可能延误诊断和治疗，因此，开发早期、快速、特异、敏感的检测技术非常必要。

近年来，随着分子诊断技术的飞速发展，聚合酶链反应(PCR)技术已经广泛应用于细菌、病毒基因水平的研究，也给微生物的快速鉴定提供了可能。针对国内流行的高致病性PRRSV变异株基因组的特点，国内学者建立了高致病性PRRSV RT-PCR检测技术(童光志，周艳君，郝晓芳.高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及其分子流行病学分析.中国预防兽医学报，2007，29(5)：321-326)，该方法可以扩增PRRSV Nsp2基因，测序后通过软件进行比较，看是否在NSP2处发生缺失或缺失的区域是否与报道的缺失区域相同。这种方法虽然能够区分普通猪蓝耳病和高致病性猪蓝耳病，但显然比较费时费力，不适用与临床检测。还有学者通过参考普通PRRSV及高致病性PRRSV变异株的Nsp2基因序列，设计一对位于紧靠缺失区两端的保守区的引物，其扩增范围覆盖整个缺失区域，缺失毒株(高致病性PRRSV变异株)和非缺失毒株(普通PRRSV株)，预期扩增产物长度分别约230bp和320bp，通过凝胶电泳分析可分别检测出普通猪蓝耳病和高致病性猪蓝耳病(郝晓芳，周艳君，田志军.高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR鉴别诊断方法的建立.中国预防兽医学报，2007，29(9)：705-709)。但该方法由于需要对PCR产物进行电泳或杂交分析等后处理，极易造成PCR产物污染，导致假阳性，不宜用于临床诊断。

实时荧光PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有核电偶联装置(CCD)的PCR扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。TaqMan PCR技术是实时荧光PCR的一种(Mackay IM et al.Real-time PCR in virology.Nucleic Acids Res.2002 5；30(6)：1292-1305；Lie，Y.S.，Petropoulos，C.J.，Advances in quantitative PCR technology：5’nuclease assays.Current Opinion inBiotechnology 1998.9，43-48.)。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。