[发明专利]丙肝病毒特异性核酶M1GS－hcv/C20的构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种丙肝病毒特异性核酶M1GS-hcv/c20及其构建方法和应用。

背景技术

目前，基于核酶P(RNase P)的反义技术在抗病毒研究领域受到广泛重视，国内外一些学者采用这类技术对包括人类巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、艾滋病毒、流感病毒等在内的多种病毒进行过研究，均发现其具有高效、特异性抑制病毒特定基因表达的作用，从而表明该技术在抗病毒领域的巨大潜力。核酶P是广泛存在于各种生物细胞(包括真核细胞、原核细胞及古细菌)内的一种天然大分子核酶，该核酶在细胞内具有分布广、含量丰富、活性高而稳定等特点，其主要生物学功能是负责前体tRNA(ptRNA)5’前导序列的特异性切除，以促进tRNA的成熟。对于任何序列已知的靶mRNA，理论上可设计一段相应的引导序列(Guide sequence，GS)与之结合并使之形成类似于ptRNA分子的结构，从而被核酶P识别并切割。

与其他类型的核酶相比，RNase P主要识别底物特定的二级结构。因此，即便靶基因一级结构的序列产生一定变异，但只要不引起其中某些特定二级结构基序的变化，仍可被RNase P识别并切割，这对于一些易变异病毒的抗病毒研究无疑具有重要意义。

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)属黄病毒科，基因组为正单链RNA，全长约9600nt。是一种慢性化率极高的肝炎病毒，变异性极高，在其自然感染的过程中可持续突变，产生不同的型或亚型，以致于在同一HCV感染者体内可同时存在具有多种序列组成不同但却有很高同源性(同源性≥95％)的HCV变异株病毒群体，称为HCV准种(Quasispecies)。丙型肝炎病毒常引起肝硬化及肝癌，对人类健康造成重大危害。目前对该病毒尚未有特异有效的防治方法，常规的干扰素疗法疗效不甚理想且易反复，探索新的防治方法具有重要意义。

因此，采用RNase P技术对HCV进行抗病毒研究并构建HCV特异性的人工核酶对于丙型肝炎病毒的抗病毒研究无疑具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是填补现有技术的空白，提供一种丙肝病毒特异性核酶M1GS-hcv/c20的构建方法。

本发明的另一个目的是提供通过所述构建方法构建得到的丙肝病毒特异性核酶的应用。

本发明的目的通过以下技术方案来予以实现：

提供一种丙肝病毒特异性核酶M1GS-hcv/c20的构建方法，选取丙型肝炎病毒HCV基因组5’UTR中21～36nt之间的序列作为靶位点设计引导序列，将引导序列与大肠埃希菌核酶P共价相联构建得到。

所述引导序列为：5’-TTCATGGTGGAGTGTC-3’。

根据任何序列已知的靶mRNA，可设计一段相应的引导序列(Guidesequence，GS)与之结合并使之形成类似于ptRNA分子的结构，从而被核酶P识别并切割的理论，本发明在大肠埃希菌(E.coli)核酶P的基础上，针对HCV基因组5’UTR设计一段GS序列，进一步将两者共价相联，成功构建了一种HCV特异性的人工核酶-M1GS-HCV/c20，并在此基础上对该人工核酶的体外切割活性进行了测定。

所述丙肝病毒特异性核酶M1GS-hcv/c20的构建方法包括以下步骤：

步骤(1)设计引导序列；

依据GS的设计原则，选取HCV基因组5’UTR中21～36nt之间的序列作为靶位点来设计GS，该区序列为5’-GACACTCCACCATGAA-3’。该靶点称为C20，针对C20靶点所设计的GS序列为：5’-TTCATGGTGGAGTGTC-3’。

本发明选择背景相对比较清楚、来源于大肠埃希菌的RNase P作为工具，针对HCV基因组序列较为保守区的5’UTR，成功将具有引导作用的GS序列与具有催化活性的RNase P亚基-M1 RNA共价结合在一起，构建了一种人工核酶-M1GS-HCV/c20。