[发明专利]对A型流感病毒复制有抑制作用的siRNA及其编码序列

说明书

技术领域

本专利涉及对流感病毒有干扰作用的siRNA序列的设计和干扰作用的鉴定

背景技术

流行性感冒(Influenza)，简称流感，被称为最古老和最致命的人类瘟疫之一。据历史记载，早在1510年英国就发生了由全球第一起由流感引起的流行病。如今，美国每年有2万人死于流感，俄罗斯每年也有1万人死于流感，英国每年有5万人由流感发展成肺炎，其中约20％死亡。据估计，全球每年流感患者死亡人数高达60万人，多于艾滋病患者死亡的人数。美国已将流感列为继心脏病、癌症、中风、肺气肿之后的威胁生命的第五大“杀手”。

流行性感冒，是由甲(A)、乙(B)、丙(C)三型流行性感冒病毒(Influenzavirus)分别引起的急性呼吸道传染病。甲乙丙不仅反映了病毒被发现的年代及前后顺序，更主要的是反映了对人类危害程度的顺序。甲型变动常以流行形式出现，引起世界性流感大流行，在动物中分布广泛，并也能在动物引起流感流行和造成大量动物死亡。

尽管由死病毒、减毒毒株或重组表面糖蛋白组成的抗流感疫苗能够有效地保护约70～80％的健康成年人免于患病，但是疫苗只能针对一小部分毒株，对于新的潜在爆发的毒株可能没有作用。而且，对于高风险人群如婴孩、老人、孕妇和其它各种免疫力低下的人群，疫苗的保护作用是非常有限的，保护率低于40％。由于大部分的死亡都是发生在高风险人群中，疫苗对于这些最需要它们的人却不能起到很好的保护作用。正在应用的几种抗流感药物也能够降低流感感染的发生和减轻流感感染时的症状。但是，药物的副作用、病人的承受能力、可能出现的抗药性变异限制了这些药物的大规模使用。所以，对于预防和治疗流感病毒感染的方法仍然有很急切的需要，特别是在高风险人群中和爆发流感时。因此，流感的防治至少在今后50年内仍然是一个严重的问题，寻找更有效的预防和治疗途径是医学研究的重大课题。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是1998年首先在线虫发现的由双链RNA介导的序列特异性的转录后基因沉默机制。RNAi一经发现，迅速成为生物学研究领域中最为活跃的热点之一，Science杂志在2001年将其列为十大科学成就之一，2002年又将其列为十大科技之首；Nature杂志也将小RNA评为2002年度最重要的科技发现之一；Andrew Z.Fire和Craig C.Mello因RNA干扰的发现而获得了2006年诺贝尔生理医学奖。随着广泛深入的实验研究的进行，人们对RNAi的机制有了更多的了解。

目前认为RNAi的主要过程为：①siRNA形成阶段。RNAi的诱导物在细胞质内被RNaseIII Dicer切割成为21-23nt的小分子干扰RNA(small interferingRNA，siRNA)，siRNA的结构特征是5′端单磷酸，3′端羟基，而且3′端有2～3-nt的碱基突出；②RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced Silencing Complex，RISC)的形成阶段。siRNA与RNAi特异性酶(如Ago-2)结合，形成RISC，具有特异性的核酸内切酶活性能特异性地降解与siRNA同源的mRNA；③效应阶段。RISC中siRNA变性，双链解开，卸下正义RNA，反义RNA仍结合在复合物上，并引导RISC与同源的靶目标mRNA结合，在核酸内切酶的作用下，将靶目标mRNA切断(切割位置在siRNA的中央，距离5′端10-nt)，从而阻断了其翻译成蛋白质，表现为基因沉默。miRNA导致基因沉默的机制与此稍有不同，它们与靶mRNA 3′非编码区(untranslated region，UTR)通过不完全互补结合，抑制翻译过程和蛋白质的合成。

RNAi能够被迅速应用于多种生物和功能的研究，得益于它的实验方法相对简单，周期短，表型易于观察。RNAi实验中最关键的因素是干扰靶点的选择、siRNA的制备和基因导入方法

作为一种快速、有效、特异的抑制基因表达的工具，尤其是发现在哺乳动物细胞也存在这一机制后，RNAi被广泛用于基因功能的研究以及肿瘤、病毒性疾病和遗传性疾病的治疗研究。