[发明专利]弥漫性大B细胞淋巴瘤相关抗原特异TCR Vβ13亚家族的RG基因序列及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一个T细胞受体(TCR)的核苷酸序列，特别是指一种弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBL)相关抗原特异TCR Vβ13亚家族的RG基因序列及应用。

背景技术

近年来，非霍奇金淋巴瘤(NHL)发病率呈持续上升趋势。据估计，21世纪初，NHL将占侵袭性恶性肿瘤的4.4％，并占所有癌症死亡数的4.8％。其中弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBL)是最常见的NHL，约占30％～40％，其中超过60岁的老年患者占70％。20多年来主要采用以CHOP方案(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松)为主的化疗。但对部分老人有毒性作用，长期生存率低。近期开展的靶向免疫治疗如利妥昔单抗(CD20单抗)的出现虽然取得了新的疗效，但微小残留病变的存在导致的疾病复发仍然是目前临床治疗的棘手问题。多年来，各国学者一直在努力寻求更有效的治疗方法。临床肿瘤学家对特异性的细胞免疫治疗寄予厚望。Xue等于报道利用从白血病患分离出能够特异识别HLA-A2限制的WT1抗原表位的CTL，将CTL的TCR基因转染患者的T淋巴细胞，在小鼠试验中显示出转染细胞的特异杀伤性。随后Tsuji等将从进一步证明了利用转导WT1特异的TCR基因的Th1和Tc1显示出HLA限制的的杀伤作用，同时转染的Th1细胞具有分泌大量IFN-γ和IL-2的功能，由于IFN-γ和IL-2在遏制肿瘤中发挥重要的作用，因而可以通过该转染相应的TCR基因的方法对肿瘤的免疫治疗发挥重要的作用。

目前利用肿瘤细胞相关抗原特异的TCR基因修饰正常T细胞(自体的或供者源T细胞)，从而获得具有杀伤相应肿瘤细胞的细胞毒T淋巴细胞(CTL)，这是近年抗肿瘤特异性细胞免疫治疗的一个重要发现。抗原特异TCR修饰正常T细胞而获得特异抗肿瘤T细胞克隆的研究首先在黑色素瘤中展开，随后有多个研究扩展了该技术的应用，如特异性抗EB病毒阳性细胞的CTL、抗WT1的CTL，个别已形成了TCL产品用于临床治疗。制备CTL产品的关键是明确肿瘤/白血病细胞的相关抗原，从而获得抗原特异的TCR，进而诱导产生特异抗白血病/肿瘤的T细胞克隆。目前国内外对淋巴瘤的研究主要集中在T细胞型淋巴瘤，而对B淋巴细胞淋巴瘤的研究资料较少，主要原因可能是对B淋巴细胞型淋巴瘤的相关抗原了解得较少有关。

发明内容

为了克服上述现有技术存在的不足，本发明的首要目的在于提供弥漫性大B细胞淋巴瘤相关抗原特异TCR Vβ13亚家族的RG基因序列。

本发明从DLBL患者外周血中存在T细胞受体(TCR)Vβ亚家族的克隆性T细胞，经序列分析显示其特异性TCR序列的高度可变区V-NDN-J区，即互补决定区3(CDR3)，与抗原特异性识别结合的部位，表明该克隆性T细胞所表达的TCR为DLBL相关抗原刺激所产生的特异性TCR，获得了DLBL相关的TCR基因序列。

本发明公开了针对DLBL相关抗原的特异性TCR的基因序列，尤其是TCR的高度可变区即CDR3，后者是T细胞表面受体识别抗原的特异区域，针对于不同抗原，除了机体所选用的TCR Vβ亚家族T细胞不同，更为关键的是其TCR基因的CDR3序列的差异，该部位决定了所属T细胞所能识别的抗原。本发明提供了一种识别DLBL相关抗原的TCR Vβ13基因序列，由于其CDR3的特异性，仅来自于单一克隆的T细胞，是一高度特异的序列。同时，根据CDR3的基因序列编码的蛋白质，可用来了解DLBL的相关抗原肽，为了解DLBL的生物学特性提供资料。

本发明的另一目的在于提供上述基因序列的应用。

根据所获得的DLBL相关抗原的特异性TCR的核苷酸序列，可以用于(1)了解DLBL病人所存在的抗DLBL的TCR Vβ13亚家族T细胞的情况，用于评价病人的免疫功能状态，(2)通过转基因技术将DLBL相关抗原的特异性TCR基因转入正常T淋巴细胞中，使其强制表达这种特异性的TCR，改变T细胞内源性TCR识别抗原的原有模式，具备分泌细胞因子和(或)特异杀伤靶细胞的功能，经体外短期培养扩增即可产生足量的CTL，再回输入患者体内使其对DLBL细胞行使靶向细胞免疫效应。

本发明的目的通过下述技术方案来实现：一种弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBL)相关抗原特异TCR Vβ13亚家族的RG基因序列，所述基因序列如下所示：