[发明专利]核酸蛋白双探针SPR生物传感DNA甲基化检测方法

权利要求书

1.核酸蛋白双探针SPR生物传感DNA甲基化检测方法，其特征在于以SPR芯片表面包被的核酸探针特异性识别待测样本中靶基因启动子区核酸序列，继而以MBD识别其中含有甲基化的部分，芯片表面形成核酸探针-甲基化靶核酸-MBD蛋白复合物，通过SPR角的变化，实现DNA甲基化的定量检测；具体步骤如下，

(1)制备甲基化阳性标准品；

(2)采用磁珠法微量核酸提取技术，提取待测体液或组织细胞样本DNA和甲基化阳性标准品DNA；

(3)制备带生物素标记的核酸探针，并包被于覆盖有亲和素的芯片表面；

(4)按从低浓度到高浓度的顺序，依次将甲基化阳性的标准品进样，继而通入经修饰的MBD，根据SPR曲线的变化，分别计算不同浓度的甲基化标准品所对应的SPR角的差值，获得标准曲线；

(5)对芯片进行再生，进待测样本DNA，继而通入MBD；根据SPR角的变化，依标准曲线计算待测样本中甲基化靶基因的含量。

2.根据权利要求1所述的核酸蛋白双探针SPR生物传感DNA甲基化检测方法，其特征在于以带生物素标记的特异性核酸探针包被于覆盖有亲和素的SPR芯片表面，识别待测样本中互补的核酸片段；以MBD识别被探针捕获的互补核酸片段中甲基化的部分。

3.根据权利要求1所述的核酸蛋白双探针SPR生物传感DNA甲基化检测方法，其特征在于步骤(1)中所述的制备甲基化阳性标准品是指：PCR扩增并纯化待测靶基因启动子核酸片段，紫外分光光度计法进行核酸定量，再行转甲基修饰，DNA 1.3μg，10×NEBBuffer 2μl，1.6mmol/L SAM 2μl，SssI Methylase 4U，总体系20μl，37℃1.5h，65℃灭活15min，即得甲基化阳性标准品。

4.根据权利要求1所述的核酸蛋白双探针SPR生物传感DNA甲基化检测方法，其特征在于步骤(3)中所述的制备带生物素标记的核酸探针是指：以待测基因启动子区富含甲基化CpG位点区域的核酸序列为模版，以5-mC替代C，化学合成5′端带生物素标记的长30-70mer的核酸探针。

5.根据权利要求1所述的核酸蛋白双探针SPR生物传感DNA甲基化检测方法，其特征在于步骤(4)中所述的经修饰的MBD是指：以胶体金或磁微球修饰MBD，以增加与甲基化CpG结合的MBD的分子量；或在MBD与甲基化CpG结合后，通入抗融合蛋白上标签的单抗。