[发明专利]新构建的高产苹果酸基因工程菌及其生产苹果酸的方法

权利要求书

1、一种高产苹果酸的基因工程菌，其分类命名为埃希氏菌属大肠埃希氏菌Escherichiacoli JM127，其保藏号登记号为CGMCC No.2300。

2、一种构建权利要求1所述高产苹果酸的基因工程菌的方法，其特征在于：以缺乏乳酸脱氢酶基因(LDH)，丙酮酸甲酸裂解酶基因(PFL)活性的菌株NZN111为出发菌株，利用同源重组技术敲除苹果酸酶(FUM)基因，并过量表达苹果酸酶后，恢复其在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，获得大肠杆菌Escherichia coli JM127。

3、根据权利要求2所述的构建大肠杆菌Escherichia coli JM127的方法，其特征包括以下构建步骤：

1)利用同源重组技术敲除苹果酸酶(FUM)基因

以两侧带有FRT位点的安普霉素抗性基因为模板，利用高保真PCR扩增系统，并设计两端带有FUM同源片段的扩增引物，成功扩增出线性DNA同源片段；

在出发菌株中导入能够诱导表达λ重组酶的质粒，使在电转入线性DNA片段后，可以抑制菌体内部的核酸外切酶，防止线性片段的分解，同时进行同源重组，通过抗性筛选获得阳性重组子；

导入能够诱导产生FLP重组酶的质粒，在诱导后，利用一对平板，进行平行点样，能够在无抗性平板上生长，但不能在抗性平板上生长的菌即为已经敲除抗性的菌株。

2)过量表达苹果酸酶，恢复其在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，获得大肠杆菌Escherichia coli JM 127。

合成一对5’端带有酶切位点的引物，以大肠杆菌K12基因组DNA为模板，纯化扩增出的sfcA基因后，表达质粒pTrc99a用与引物所设计的酶切位点一致的酶双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-sfcA；

将质粒pTrc99a-sfcA导入之前消除安普霉素抗性菌株的感受态，获得的阳性转化子即为Escherichia coli JM127；

在成功敲除FUM基因后，超量表达苹果酸酶，恢复在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力。

4、一种利用权利要求1所述的高产苹果酸的基因工程菌Escherichia coli JM127发酵生产苹果酸的方法，其特征在于采用两阶段发酵方式，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段发酵产酸。

5、根据权利要求4所述的采用两阶段发酵方式，其特征在于按1％(v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD₆₀₀至0.8～1.0左右用0.7mM的IPTG诱导至OD₆₀₀＝3左右时，按接种量10％转接至血清瓶中厌氧发酵。

6、一种利用如权利要求4所述的高产苹果酸的基因工程菌Escherichia coli JM127发酵生产苹果酸的方法，其特征在于发酵在经历有氧发酵阶段后采用膜分离过程，再进而用于厌氧发酵。

7、根据权利要求6所述的采用两阶段发酵方式，其特征在于按1％(v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD₆₀₀至0.8～1.0左右用0.7mM的IPTG诱导至OD₆₀₀＝3左右时，经膜处理后，按接种量10％转接至血清瓶中厌氧发酵。

8、根据权利要求6和7所述的膜分离过程，其特征在于采用的膜为微滤膜。