[发明专利]检测头孢类抗生素的免疫层析试纸条的制备方法

说明书

技术领域

检测头孢类抗生素的免疫层析试纸条的制备方法，本发明涉及免疫学检测领域，具体涉及到免疫胶体金试剂的制备及试纸条的制备。

背景技术

因为现有兽药种类繁多，就头孢类抗生素也有很多种，仅是单残留检测远不能满足对兽药滥用而导致的药物残留的很好检测，且对于发酵奶的生产至少实现对一类抗生素的检测是很有用的。现有的能实现多残留检测的方法主要是仪器分析，其中包括高效液相色谱法、液质联用(HPLC-MS)、气质联用(GC-MS)等。但这些检测方法需要昂贵的仪器设备，操作需要专业技术人员，且不能适应高通量、现场的快速检测。因此实现具有快速，便携优点的免疫检测方法的多残留检测具有现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测头孢类抗生素的免疫层析试纸条的制备方法，为了克服现有检测技术的缺陷，提供一种便携、快速、适合进行现场检测的免疫层析色谱检测法(gold immunochromatography assay；GICA)，且能实现至少两种头孢类抗生素的多残留检测。同时提供该检测试纸条的制备方法。

本发明的技术方案：一种检测头孢类抗生素的免疫层析试纸条，由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬组成，PVC背衬上依次粘贴样品垫、结合垫，硝酸纤维素膜，吸水垫，结合垫上包被了抗头孢类抗生素的簇特异性抗头孢类抗生素抗体-胶体金标记物，硝酸纤维素膜上依次包被有头孢氨苄-OVA检测线和羊抗兔IgG质控线。

所述检测头孢类抗生素的免疫层析试纸条的制备方法，制备步骤为：

(1)制备头孢氨苄-OVA偶联物：将头孢氨苄与OVA以100∶1摩尔比溶于pH7.4、0.01mol/L PBS中，搅拌下加入戊二醛交联剂，戊二醛摩尔用量为头孢氨苄摩尔量的1/10，室温反应3h，4℃透析3天，形成头孢氨苄-OVA偶联物；

(2)制备胶体金：用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm-40nm胶体金颗粒；

(3)制备抗头孢类抗生素多克隆抗体-胶体金标记物：将3mL胶体金调至pH 9，搅拌下逐滴加入蛋白浓度为0.075mg/mL的抗头孢类抗生素多克隆抗体0.2mL，放置30min后加入牛血清蛋白BSA使终浓度为1％，放置至少30min后，10000转50min离心，并用0.002mol/L、pH9.0的硼酸盐缓冲液3mL重悬两次，最后用该硼酸盐缓冲液0.3mL重悬，得到稳定的抗头孢类抗生素多克隆抗体-胶体金标记物；

(4)将抗头孢类抗生素抗体-胶体金标记物包被在胶体金结合垫上，将头孢氨苄-OVA偶联物和羊抗兔IgG分别包被在作为反应垫的硝酸纤维素膜的检测线和质控线，在37℃烘箱干燥；

(5)试纸条的组装：将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫由一端依次黏附在PVC背衬上，即得到用于检测的免疫层析试纸条。

抗头孢类抗生素的多克隆抗体的制备：用上述相同的戊二醛方法制备头孢氨苄-KLH偶联物，用此偶联物多次免疫新西兰纯种大白兔，并在三次加强免疫后测定其效价和抑制率，在适合的时候心脏采血，分离血清。血清用proteinG亲和柱进行纯化即可得到高纯度的抗头孢类抗生素的多克隆抗体。

本发明的有益效果在于：快速，仅需要5-10分钟；便携，适合现场检测；操作简便，不需要专业技术人员。且能够同时进行多种头孢类抗生素的检测。

附图说明

图1组装完成的免疫层析试纸条结构。

具体实施方式

实施例1

PVC背衬一端依次粘贴样品垫、结合垫，中间粘附硝酸纤维素膜，另一端粘附吸水垫，结合垫上包被了抗头孢类抗生素的簇特异性抗体-胶体金标记物，硝酸纤维素膜上包被了头孢氨苄-OVA，和羊抗兔IgG。

按以下步骤制备：(1)制备头孢氨苄-OVA偶联物：将头孢氨苄与OVA以100∶1摩尔比溶于PBS(0.01mol/L、pH7.4)，搅拌下加入戊二醛交联剂，反应3h，4℃透析3天。形成头孢氨苄-OVA偶联物；

(2)制备胶体金：用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm-40nm胶体金颗粒；

(3)制备多克隆抗体-胶体金标记物：将胶体金调至pH 9左右，搅拌下逐滴加入最佳标记量的多克隆抗体，放置30min后加入适量BSA，放置至少30min后，10000转50min离心并重悬两次，最后一次用1/10量的重悬液重悬，得到稳定的多克隆抗体-胶体金标记物；