[发明专利]LKB1基因Thr336磷酸化多克隆抗体制备方法及在肿瘤发生中检测的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体是一种LKB1基因Thr336磷酸化多克隆抗体制备及在肿瘤发生中检测的应用。

背景技术：

LKB1基因，又名STK II(serinePthreonine proteinkinase 11)基因，是由Hemminki等在1998年从Peutz Jeghers syndrome(PJS)患者的血细胞中克隆出来的一种基因，PJS是一种常染色体显性遗传疾病，患者不但肠道、胃、胰腺发生恶性肿瘤的可能性增加，而且在乳腺、子宫颈、肺、卵巢、睾丸发生恶性变危险度也增加，初步估计93％的PJS患者平均在43岁时发生恶性肿瘤。研究表明LKB1基因的突变失活不仅存在于PJS相关性肿瘤中而且在PJS非相关性肿瘤如直肠癌、胃癌、睾丸肿瘤、乳腺癌、胰腺肿瘤、卵巢肿瘤、宫颈癌、黑色素瘤、肺癌中也普遍存在，提示LKB1在这些肿瘤的发生中可能扮演了肿瘤抑制基因的作用。Lkb1基因定位于人19p13.3带，cDNA全长2158bp，编码区1302bp，有9个外显子，是由433个氨基酸组成的分子量为50KD的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其N端含有一个核定位信号区和胞浆定位区LKB1的某些磷酸化位点是其发挥抑制细胞生长功能所必须的。现已知LKB1的磷酸化位点有8个：Ser31，Ser325，Thr366和Ser431可被其上游的激酶磷酸化，而Thr185，Thr189，Thr336和Thr402是自磷酸化的位点。

Gopal P.SAPKOT等人制备了LKB1的Thr336磷酸化抗体，抗原为329-343位点的15个氨基酸：KDRWRSMTpVVPYLED，用此抗原免疫家兔获得抗血清，先用连有该磷酸化肽段的CH-Sepharose吸附纯化，然后再通过连有非磷酸化肽段CH-Sepharose进一步纯化。在不含LKB1的G361细胞中过表达GST-LKB1能够抑制细胞生长，而LKB1的突变体(T336A)则阻止了LKB1的抑制效果，而其他自我磷酸化位点的突变确没有此效果，说明Thr336位点在LKB1抑制细胞生长中发挥着重要的作用(Gopal P.SAPKOT，2002)。

发明内容

本发明的目的是提供一种LKB1基因Thr336磷酸化多克隆抗体制备方法及在肿瘤发生中检测的应用，通过生物信息学分析法设计Thr336-p-LKB1特异性氨基酸序列，并用该多肽免疫家兔以获得特异性的抗体，为LKB1蛋白功能研究和肿瘤诊断提供有力工具。

本发明的技术方案如下：

LKB1基因Thr336磷酸化多克隆抗体制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)、通过生物信息学方法选取LKB1基因的Thr336位点附近10个氨基酸WRSMT_pVVPYL，且使Thr336位点磷酸化，并铰链上BSA以增强其抗原性，以此为Thr336-p-LKB1抗原，对兔子进行免疫获得Thr336-p-LKB1抗血清；

(2)、用Thr336-p-LKB1抗原条进行抗血清纯化：

(3)、制备的抗血清通过Western blot检测抗体效价及特异性检测，Thr336-p-LKB1抗体阴性对照的底物为融合表达蛋白His-LKB1，阳性对照的底物为Thr336-p-LKB1抗原肽段。

所述的LKB1基因Thr336磷酸化多克隆抗体制备方法，其特征在于更为具体的步骤为：

(1)、通过生物信息学方法选取LKB1基因的Thr336位点附近10个氨基酸WRSMT_pVVPYL，且使Thr336位点磷酸化，并铰链上BSA，以此为Thr336-p-LKB1抗原，对兔子进行免疫获得Thr336-p-LKB1抗血清；

(2)、用Thr336-p-LKB1抗原条进行抗血清纯化：

Thr336-p-LKB1抗原条的制备：将蛋白质电泳的加样孔制成一个长槽，以增加上样量，Thr336-p-LKB1抗原经SDS-PAGE，转膜，根据丽春红染色结果，剪下目的条带，即为Thr336-p-LKB1抗原条；