[发明专利]一种高温角质酶及其基因序列

权利要求书

1.一种高温角质酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。

2.一种编码权利要求1所述的高温角质酶的基因，其核苷酸序列为SEQ IDNO：1所示。

3.一种如权利要求2所述的高温角质酶基因的表达方法，其特征是由嗜热子囊菌(Thermobifida fusca)WSH03-11总DNA获得高温角质酶基因SEQ IDNO：1，角质酶基因以质粒pET20b(+)为表达载体，以大肠杆菌(E.coli)BL21Rosetta(DE3)PlysS为表达宿主，实现高温角质酶基因的高效表达；

(1)嗜热子囊菌WSH03-11总DNA的提取：

嗜热子囊菌WSH03-11菌株在LB液体培养基中培养2天，10000rpm离心收集菌体，无菌水洗涤，收集沉淀悬浮于500μL Tris-EDTA缓冲液，加入15μL溶菌酶，37℃下保温30min，再加入5μL RNA酶，37℃下保温30min，加入30μL10％十二烷基硫酸钠和15μL蛋白酶K，37℃下保温60min，加入100μL 5M的NaCl和80μL十六烷基三甲基溴化铵，65℃下保温20min，用700μL的酚∶氯仿∶异戊醇体积比25∶24∶1混合溶剂抽提，10000rpm离心，上清液用700μL的氯仿∶异戊醇体积比24∶1抽提，10000rpm离心，上清液用1400μL的冰异戊醇混合，-20℃沉淀30min，10000rpm离心，沉淀加200μL 70％乙醇清洗，10000rpm离心，沉淀用Tris-EDTA缓冲液溶解，即为嗜热子囊菌WSH03-11总DNA；

(2)高温角质酶编码基因的克隆：

以嗜热子囊菌WSH03-11总DNA为模版，以下列核苷酸序列作为引物，下划线为酶切位点Nco I和EcoR I，PCR扩增高温角质酶基因；

引物1：5’-ggAATACCATATgTCCATggCCAACCCCTACgAgCgCgg-3’

引物2：5’-CATCTCgAgAgAATTCgggAACgggCAggTggAgCg-3’

PCR反应在50μL体系中进行，反应条件为在95℃变性5min后开始循环，然后95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环后，再于72℃延伸10min，扩增得到780bp的PCR片段，割胶回收，回收片断与pMD18-Tsimple载体连接，连接产物转化大肠杆菌(E.coli)JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，10h后提取质粒，命名为CUT-pMD18-T simple，将此质粒进行序列测定；

(3)高温角质酶基因的改造：

以CUT-pMD18-T simple为模板进行定点突变PCR，设计引物：

引物3：5’-CATgggCCACTCAATgggCggCggCggC-3’

引物4：5’-gCCgCCgCCgCCCATTgAgTggCCCATg-3’

PCR反应在50μL体系中进行，反应条件为在95℃变性5min后开始循环，然后95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸4min，共35个循环后，再于72℃延伸10min，将PCR产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，转化后的菌体涂布100mg/L氨苄青霉素LB平板，挑选单菌落接入100mg/L氨苄青霉素LB液体培养基经37℃过夜培养，抽提质粒，将突变后的质粒进行序列测定；

(4)高温角质酶基因在表达载体上的构建：

用于构建表达载体的质粒是pET20b(+)，带有pelB信号肽和His-tag标记，将pET20b(+)质粒和角质酶基因进行Nco I和EcoR I双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，经37℃培养过夜，挑选转化子于100mg/L氨苄青霉素LB进行液体培养，然后抽提质粒，得到富集的CUT-pET20b(+)质粒；

(5)大肠杆菌宿主转化和筛选重组菌：

将质粒CUT-pET20b(+)热击转化大肠杆菌BL21 Rosetta(DE3)PlysS宿主菌，再在含100mg/L氨苄青霉素和50mg/L氯霉素的LB平板上经37℃培养过夜，挑选重组菌CUT-pET20b(+)/大肠杆菌BL21 Rosetta(DE3)PlysS转化子在TB培养基中37℃液体培养过夜，后接入TB发酵液体培养基37℃培养至OD达1.5后用终浓度4μM异丙基硫代βD半乳糖苷诱导，降温至24℃培养，64h时产酶达69U/mL；

(6)重组高温角质酶的纯化和特性：

将上述角质酶发酵液于4℃、10000rpm离心20min除菌体；上清液中加入70％固体硫酸铵盐析过夜，4℃、10000rpm离心20min，取沉淀物用适量含20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、20mM咪唑、pH 7.4的缓冲液A溶解，并在缓冲液A中透析过夜后，通过0.22μm膜过滤后制成上样样品；Ni亲和柱用缓冲液A平衡后，将上样样品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分别用缓冲液A～含480mM咪唑的缓冲液A梯度洗脱，流速1mL/min，检测波长为280nm，分部收集含角质酶酶活的洗脱液；活力组分用10000道尔顿膜离心浓缩，得纯化角质酶酶制品。