[发明专利]一株产丙酮酸重组菌的构建及用其提高丙酮酸生产强度的方法

权利要求书

1、一株产丙酮酸重组菌，其分类命名为光滑球拟酵母Pdnox E，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 208022。

2、一种光滑球拟酵母Pdnox E CCTCC NO：M 208022的构建方法，其特征是运用分子手段，以乳酸乳球菌NZ 9000基因组为模板，PCR扩增得到目的基因noxE片段，目的基因noxE经限制性内切酶EcoR I和BamH I双酶切消化后，浓缩纯化，将noxE基因定向克隆到表达质粒pYX212中，得到重组酵母表达质粒；将重组酵母表达质粒用电击转化的方法，转入受体菌Torulopsis glabrataCCTCC NO：M202019，在MM培养基中进行筛选，得到NADH氧化酶过量表达的重组菌PdnoxE CCTCC NO：M 208022。

3、一种通过辅因子NADH调控碳代谢流加强丙酮酸生产强度的方法，其特征是采用光滑球拟酵母PdnoxE CCTCC NO：M 208022为出发菌株，经种子培养和液体发酵生产丙酮酸；

种子培养：种子培养基以g/L計：葡萄糖30，蛋白胨10，KH₂PO₄ 1，MgSO₄·7H₂O 0.5，调pH 5.5；培养条件：温度30℃，摇床转速200rpm，培养时间为20-24h；

液体发酵培养：发酵培养基以g/L計：葡萄糖100，乙酸钠6，NH₄Cl 7，KH₂PO₄ 5，MgSO₄·7H₂O 0.8，CaCO₃ 40，微量元素液10mL，维生素液10mL，pH5.0；发酵条件：将种子液以10％的接种量分别转入发酵培养基于30℃、200rpm条件下培养，发酵进行到36h葡萄糖消耗完毕，补加50g/L葡萄糖继续发酵20h，使丙酮酸浓度提高；

所用微量元素液为：CaCl₂·2H₂O 2g，FeSO₄·7H₂O 2g，ZnCl₂ 0.5g，MnCl₂·4H₂O 12g，CuSO₄·5H₂O 0.05g，2mol/L HCl溶解后定容至1L；

所用维生素液为：烟酸80mg，硫胺素0.15mg，吡哆醇40mg，生物素4mg，核黄素10mg，自来水定容至1L。

4、根据权利要求3所述的方法，其特征是CCTCC NO：M 208022菌株的NADH氧化酶活性为34.8U/mg protein，与工业菌株Torulopsis glabrata CCTCCNO：M202019相比，菌体干重、葡萄糖消耗速度和丙酮酸生产强度分别提高了168％、44.9％和12％；发酵进行到36h葡萄糖消耗完毕，补加50g/L葡萄糖继续发酵20h，使丙酮酸浓度提高到67.2g/L。