[发明专利]一种产红霉素B的糖多孢红霉菌突变体的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术，具体是一种产红霉素B的糖多孢红霉菌突变体的构建方法。

背景技术

红霉素A(erythromycin A，ErA)是广泛用于临床的广谱大环内酯类抗生素，由革兰氏阳性菌糖多孢红霉菌产生，红霉素A的生物合成基因成簇存在于染色体上，合成途径可以分为两大部分：红霉素母核6-脱氧-红霉内酯B(6-deoxy-erythronolide B，6-dEB)的合成和6-dEB的后修饰。前者由聚酮合成酶复合体(PKS)催化完成，后者包括6-dEB在C-6位羟基化及在C-3位和C-5位羟基糖基化形成红霉素D等修饰步骤。

糖多孢红霉菌中的红霉素C-12羟化酶EryK是一个细胞色素P450单加氧酶，负责ErD或红霉素B的C-12位点特异性羟基化修饰。虽然EryK能催化ErB的羟基化合成ErA，但在糖多孢红霉菌中生物合成最佳路径是经ErD氧化到红霉素C再合成ErA，其在动力学上比ErD经ErB途径高1200-1900倍。在目前被发现的放线菌抗生素生物合成过程中，很多中间产物会被P450单加氧酶羟基化。随着越来越多生物基因组测序完成，对放线菌细胞色素P450单加氧酶家族的认识也愈加深入。最近在糖多孢红霉菌中通过基因操作改变聚酮合成的后修饰步骤，特别是P450单加氧酶催化步骤，合成了许多新的酮内酯类抗生素；以及通过提高P450单加氧酶的酶活提高糖多孢红霉菌及其它菌株抗生素的工业产量。为了研究逐渐增多的糖多孢红霉菌改造菌株，深入了解它们的P450单加氧酶也变得越来越重要。本发明用染色体同源重组方法，将糖多孢红霉菌A226中eryK关键氨基酸序列的DNA片段敲除，继而将P450单加氧酶EryK失活，为工业发酵生产红霉素B提供了菌株，也为探讨P450单加氧酶EryK功能、酶学性质以及用基因工程或化学修饰方法合成更多红霉素衍生物奠定了基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种产红霉素B的糖多孢红霉菌突变体的构建方法，利用染色体同源重组的方法，将糖多孢红霉菌中eryK关键氨基酸序列DNA片段敲除，继而使P450单加氧酶EryK失活，为工业发酵生产红霉素B创造了条件，也为探讨P450单加氧酶EryK功能、酶学性质以及用基因工程或化学修饰方法合成更多红霉素衍生物奠定了基础。

本发明的技术方案如下：

一种产红霉素B的糖多孢红霉菌突变体的构建方法，其特征在于：利用基因工程方法使得糖多孢红霉菌羟基化酶EryK基因删除，或删除包括有BC loop氨基酸序列对应的DNA片段，或对EryK羟基化酶基因插入失活，得到主产红霉素B的糖多孢红霉菌突变体。

所述的一种产红霉素B的糖多孢红霉菌突变体的构建方法，其特征在于：先用重叠PCR从糖多孢红霉菌基因组中，扩增出羟基化酶EryK中BC loop氨基酸序列缺失所对应的eryK基因DNA片段，将其连到质粒pWHM3上构建成重组质粒，再将重组质粒转化到糖多孢红霉菌中，使其发生染色体同源重组，筛选出EryK BC loop氨基酸对应DNA序列缺失的糖多孢红霉菌突变体，其发酵主产物为红霉素B。

所述的一种产红霉素B的糖多孢红霉菌突变体的构建方法，其特征在于所述的删除或插入失活方法是指下列方法之一：(1)先用重叠PCR从糖多孢红霉菌基因组中扩增出羟基化酶基因eryK缺失或部分缺失的DNA片段，将其连到质粒pWHM3上构建成重组质粒，再将重组质粒转化到糖多孢红霉菌中，使其发生染色体同源重组，筛选出eryK基因删除或缺失的糖多孢红霉菌突变体，其发酵主产物为红霉素B；(2)使用PCR方法扩增出EryK羟基化酶基因eryK全部或部分DNA片段，将其连到质粒pWHM3上，构建成重组质粒，再将重组质粒转化到糖多孢红霉菌中，使其插入羟基化酶基因eryK上，使其表达的羟基化酶失活，所构建的孢红霉菌突变体，其发酵主产物为红霉素B。

以糖多孢红霉菌A226基因组DNA为模板，用重叠PCR方法扩增出去除羟基化酶EryK BC loop基因序列中101bp，克隆于同源重组质粒pWHM3，构建了同源重组质粒pWHM3-ΔeryK。PEG介导原生质体转化法将pWHM3-ΔeryK转入糖多孢红霉菌A226，通过同源重组整合到红霉素合成基因位点上。整合体在无抗R3M斜面培养基上连续生长三代后，制备原生质体涂R3M平板。利用薄层层析、PCR和质谱方法检测筛选出一株eryK基因失活的糖多孢红霉菌突变体AK17，此突变体主要积累红霉素B产物，而不再合成红霉素A。

附图说明

图1：pUC18-ΔeryK质粒的鉴定