[发明专利]利用胚挽救获得三倍体葡萄及倍性早期鉴定的育种技术

说明书

技术领域

本发明涉及植物育种技术，特别是涉及利用胚挽救培养获得三倍体葡萄杂交幼苗，对所得杂种后代进行系统而全面的倍性早期鉴定的高效育种技术，属于生物技术领域。

背景技术

多倍体育种是培育果树新品种的重要途径，其优越性在于所表现出的生长旺盛、枝粗、叶厚、果大、产量高及适应性强等特点，而多倍体产生途径有自然芽变、人工化学诱变、人工有性杂交、胚乳培养及花药培养等。其中利用二倍体品种与四倍体之间进行杂交应用最广，已在西瓜、香蕉、柑桔中取得成果，获得了三倍体无籽果。葡萄作为全球性第二大水果，其无核品种一直是当前国际消费的重要方向，而获得大粒无核葡萄新品种长期以来备受育种学家的重视。三倍体葡萄除具有多倍体植株的诸多优越性外，其果实无核或少核，因此三倍体葡萄育种开拓了培育大粒无核葡萄品种的新途径。据研究报道，日本已育成三倍体无核葡萄品种尾玲、戴拉王、蜜无核、甲斐美嶺、夏黑，我国已育成三倍体无核早红，并在生产上开始推广。

三倍体葡萄品种可通过二倍体和四倍体品种间杂交、自然杂交、三倍体品种的芽变、胚乳培养和花药培养等多种途径产生，但实际上，最有效的途径仍然是利用二倍体和四倍体直接杂交。但是二倍体和四倍体杂交的最大障碍是亲和力差，座果率低，杂种胚早期败育或胚乳解体，获得三倍体杂交种子生活力低，很难获得杂交后代。利用胚挽救技术，可阻止三倍体杂交幼胚的早期败育，形成三倍体植株。

从上个世纪以来，经过胚珠培养，日本学者山下裕之利用有核葡萄的四倍体和二倍体杂交，获得了三倍体植株(《园艺学会杂志》1993，62(2)：249-255)，其后李世诚(《上海农业学报》1998，14(4)：13-17)、潘春云(《山东农业大学学报》1998，29(3)：299-302)、徐海英(《果树学报》2001，18(6)：317-320)、郭印山(《沈阳农业大学学报》2005，36(5)：606-608)等也采用胚挽救技术，克服了葡萄二倍体与四倍体常规育种中杂交胚早期败育、育种效率低的障碍，成功的育成了三倍体杂种幼苗，但少有系统的对所得杂交幼苗进行全面倍性检测，缺少完整高效的育种体系。

通常多倍体鉴定的方法有植物性状鉴定、细胞学鉴定、分子生物学鉴定等方法，而葡萄多倍体多采用显微镜下染色体数目鉴定，也有利用流式细胞仪进行测定，染色体计数法直观有效，但材料仅限于茎尖和根尖，且操作复杂。流式细胞仪是对待测植株DNA含量进行鉴定，在短时间内可检测成千上万个细胞，能保证获得生物体细胞的群体特征，测量快速，结果可靠，但仅能提供半定量的测量结果。

发明内容

本发明的目的就是针对现今三倍体葡萄育种现状以及各种多倍体鉴定方法的优缺点，利用胚挽救培养获得三倍体葡萄杂种幼苗，结合流式细胞术、去壁低渗法染色体计数，对所得杂种后代进行系统而全面的倍性早期鉴定，提高三倍体葡萄的育种效率。

本发明的实施步骤如下：

a.葡萄育种田间杂交

采取花粉，在四倍体品种父本开花前1天或开花初期，采下发育正常的花序，除去顶部约三分之一的部分，摘下花冠及花药后用纱网筛过后，在日光灯下烘干至花药裂开，再次筛后倒入研钵中，研磨至粉状，装入处理干净的小瓶，封口，放在装有无水CaCl₂的干燥器中，4℃低温保存；去雄授粉，选择欧洲无核葡萄品种母本树上发育一致的花序若干，开花前3-4天进行人工去雄，之后立即用清水喷洒花序，并套袋和挂牌标记，当柱头上开始分泌水滴状粘液时，用脱脂棉蘸取花粉进行人工授粉，连续授粉3次，每天1次；

b.胚挽救培养及成苗