[发明专利]成年大鼠心脏微血管内皮细胞体外分离、扩增的方法

说明书

一、技术领域：

本发明涉及一种成年大鼠心脏微血管内皮细胞体外分离、扩增的方法，其为一种利用大鼠心脏微血管内皮细胞的生物学特性，采用胶原酶快速消化及胰蛋白酶传代分离扩增大鼠心脏微血管内皮细胞的方法。

二、背景技术：

微血管起源的内皮细胞不同于大血管起源的内皮细胞，并且不同器官组织起源的血管内皮细胞也表现出不同的功能特性。内皮细胞内分泌功能相当活跃，由于其特殊的生理位置，心肌微血管内皮细胞不仅受到血液灌注压力和血液流动切应力的直接作用，还受到其他器官所没有的反复挤压影响，导致微血管内细胞无论是在形态，结构，功能还是遗传方面都不同于大血管内皮细胞：一方面，内皮细胞内分泌功能相当活跃；另一方面，由于其特殊的生理位置，心肌微血管内皮细胞不仅受到血液灌注压力和血液流动切应力的直接作用，还受到其他器官所没有的反复挤压影响，导致微血管内细胞无论是在形态，结构，功能还是遗传方面都展示着不同之处：

形态学方面：大血管内皮细胞呈典型内皮细胞的多角形态，而微血管内皮细胞则形态变化更多，且呈铺路石状生长。

在免疫组化方面：VIII因子相关抗原对包括大血管及微血管在内的内皮细胞具有特异性和敏感性，但是在心内膜内皮细胞它只是弱阳性，在心外膜是阴性。此外，抗CD-31抗体以及抗血管紧张素转化酶(ACE)抗原、乙酰化低密度脂蛋白(DiI-Ac-LDL)摄取特点在心脏内皮细胞中的表现也提示我们可以用来进行相关的鉴定：其中对乙酰化低密度脂蛋白吞噬的特点是国际公认的鉴定方法。

在相关的酶活动性实验中：微血管内皮细胞包含的Neutralendopeptidase(NEP)要少于大血管内皮细胞，内皮细胞通过纤溶酶原和其抑制剂参与纤溶系统的运行，大血管和微血管内皮细胞产生的血浆纤溶酶原激活物(t-PA)相当，但是，微血管内皮细胞产生的t-PA抑制剂却较少。

在遗传方面：无论是在体内还是体外，均可以观察到心肌微血管内皮细胞和大血管内皮细胞在分子水平上所保持的区别。

三、发明内容：

本发明的目的在于提供一种成年大鼠心脏微血管内皮细胞体外分离、扩增的方法，其提供了心脏内皮功能相关研究的理想细胞模型以及心肌梗死后血管新生治疗以及组织工程细胞的补充来源，为深入研究临床治疗心肌梗死、心血管内皮功能障碍等奠定了基础。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种成年大鼠心脏微血管内皮细胞体外分离、扩增的方法，其特征在于：(1)利用心脏微血管内皮细胞的生物学特性，采用酶消化法分离富集成年大鼠心脏微血管内皮细胞，利用内皮细胞的自我更新和增殖特性进行扩增，从而获得大量心脏微血管内皮细胞；(2)分离出的细胞在体外进行分离纯化；(3)分离出的细胞在体外进行纯化扩增。

在步骤(1)中，采用DMEM+20％新生牛血清作为基本培养基。

在步骤(1)中，通过0.2％II型胶原酶震荡消化5min，加0.1％胰蛋白酶继续消化5min，用含20％新生牛血清DMEM培养液终止消化，从而获得高纯度大量心脏微血管内皮细胞。

在步骤(2)中，将得到的细胞接种于铺有鼠尾胶的培养皿中，置于37℃恒温的5％CO2培养箱中孵育，从而获得高纯度大量心脏微血管内皮细胞。

在步骤(3)中，在传代培养中采用胰蛋白酶降低非CMECs的贴壁能力，根据不同的贴壁时间达到纯化的目的。

在步骤(3)中，通过及时、反复传代对成年大鼠心脏微血管内皮细胞进行纯化和扩增培养，从而达到扩增的目的。

上述方法的详细步骤：取2只SD大鼠，3％戊巴比妥钠30mg/Kg腹腔麻醉后打开胸腔，摘取心脏，用PBS缓冲液冲洗心腔直至冲出液清亮为止；去除心房及右心室后，沿前壁切开左心室，75％酒精灭活30s后迅速取出，置于PBS缓冲液中去除残余的酒精。剪去内、外膜，剪碎心肌组织，0.2％II型胶原酶震荡消化5min，加0.1％胰蛋白酶继续消化5min，用含20％新生牛血清DMEM培养液终止消化；收集消化液，1000r/min离心10min。弃上清，用含20％新生牛血清，青霉素100IU/ml，链霉素100μg/ml的DMEM培养液悬浮细胞，接种于铺有鼠尾胶的培养皿中，置于37℃恒温的5％ CO2培养箱中孵育6h换液，以后每三天换培养液一次至细胞长成融合单层；0.25％胰蛋白酶消化传代至盖玻片上，待长满后用PBS洗三遍，置冰丙酮中固定20min备用。

与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：