[发明专利]一种遗骸核DNA个体识别的新方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种识别方法，特别是一种遗骸核DNA个体识别的新方法，该方法可以获得高质量的核DNA，解决了尸体毁损后遗骸的个体识别、性别鉴定、亲权鉴定，从而为司法侦破、审判、保险等提供科学依据。

背景技术

谋杀、碎尸、无名尸或火灾、爆炸、飞机坠毁等重大意外事故造成的多人遇难、尸体毁损，个人身体特征(面貌、指纹、衣着等)及身体软组织完全破坏，遗留物只有骨、牙等硬组织。传统的个体识别方法对碎尸、无名尸、白骨化等毁损尸体的认定多依靠残存皮纹、骨骼形态学等特征进行推断。虽然传统的方法能够提供信息，但不足以对碎尸、无名尸或火灾、爆炸、飞机坠毁等重大意外事故造成的多人遇难、尸体毁损进行完整的个体识别和分析。而这些事故的遗留物往往只有骨、牙等硬组织，很难通过传统的方法和遗传标记达到个体识别的目的。

目前，针对人体硬组织的DNA提取方法，众多的实验室研究人员致力于最大程度提高DNA产量，同时将PCR反应抑制物降低到最小。常用的方法有：有机溶剂法、盐析法、Chelex-100法及硅珠法。比较这些方法的提取、扩增效率和实际操作过程，硅珠法是简便、高效、低成本以及低污染的最佳选择。

1、有机溶剂法：

通过酚-氯仿混合物萃取DNA溶液中的蛋白质类有机物质，而保留DNA于水相溶液中。适用所有生物检材，其提取DNA量比Chelex法和无机盐提取法多，且DNA分子结构完整，特别适合RFLP、测序等需要大分子DNA分析技术。

1)所需试剂及仪器

微型高速离心机：速度15000r/min；

37℃、56℃干热器：96孔×4，可调温度5℃～100℃±1℃；

20ul、200ul、l00ul微量移液器：误差应少于1ul；

细胞溶解缓冲液(CLB)：蔗糖、MgCl₂、TritonX-100；

蛋白溶解缓冲液(PLB)：EDTANa，NaCl；

氯仿∶异戊醇(24∶1)；

饱和酚；

蛋白酶K缓冲液：蛋白酶K 20mg/ml；

70％酒精：冷；

无水乙醇：冷；

2)操作步骤：

●将1ml EDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml离心管中，加入1ml磷酸缓冲盐溶液(PBS)，混匀，3500rpm离心15min，倾去含裂解红细胞的上清。重复一次。用0.7ml DNA提取液混悬白细胞沉淀，37℃水浴温育1h。

●将上述DNA提取液混悬白细胞，37℃水浴温育1h后，加入1mg/ml蛋白酶K 0.2ml，至终浓度为100-200ug/ml，上下转动混匀，液体变粘稠。50℃水浴保温3h，裂解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。

●反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管5-10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，上下转动混匀，5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复一次。

●加入1/5体积的3mol/L NaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一1.5ml离心管中，加70％乙醇0.2ml，以5000rpm离心5min。洗涤DNA，弃上清，去除残留的盐。重复一次。室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。加TE液20ul溶解DNA，置于摇床平台缓慢摇动，DNA完全溶解通常需12-24h。制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。

2、盐析法：

无机盐提取法是用醋酸钠通过盐析原理去除非核酸物质，主要用于血液与血痕、精液或精斑、毛发样本，其优点是提取DNA回收率高，DNA质量也好于Chelex-100方法。

1)所需试剂及仪器

微型高速离心机：44孔，速度15000r/min；

37℃、56℃干热器：96孔×4，可调温度5℃～100℃±1℃；

20ul、200ul、100ul微量移液器：误差应少于1ul；

细胞溶解缓冲液(CLB)：蔗糖、MgCl₂、TritonX-100；

蛋白溶解缓冲液(PLB)：EDTANa，NaCl；