[发明专利]可溶性人程序性死亡蛋白－1－IgV及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，涉及基因合成、蛋白表达纯化、体外活性检测、动物体内抑瘤检测等技术，特别涉及一种可溶性人程序性死亡蛋白-1-IgV(hPD-1-IgV)及其制备方法。

背景技术

机体免疫系统可以识别“自我/非我”，对“非我”进行免疫监视、识别和应答，以至将其消除。然而，这种机体强大的免疫保护系统，在肿瘤面前却显得束手无策。肿瘤在人体强大的免疫功能作用下仍能发展、转移，表明肿瘤具有自己的保护机制。肿瘤细胞可以通过对自身表面抗原的修饰及改变肿瘤组织周围的微环境来逃避机体的免疫识别与攻击，这就是肿瘤的免疫逃逸。肿瘤存在着许多逃逸免疫系统识别和攻击的机制，包括：HLA-I类抗原和免疫共刺激分子的表达下调或丢失；肿瘤抗原的表达下调、丢失或突变；肿瘤细胞分泌免疫抑制性可溶性因子；肿瘤细胞膜上表达免疫抑制性分子；诱导具有免疫抑制功能的调节性T淋巴细胞等。其中，肿瘤来源的可溶性免疫抑制因子，以影响树突状细胞(DC)以及淋巴T细胞的功能为主。这些因子致使髓样细胞的不正常分化，导致全身性成熟DC数量下降、不成熟DC(iDC)数量增加及不成熟髓样细胞(iMCs)的增加。主要有：白细胞介素-10(IL-10)，转化生长因子-β(TGF-β)，前列腺素E2PGE2)和趋化因子(如CCL2/MCP-1)等。在抗肿瘤免疫效应中，CD8⁺T细胞起主要作用，通过对肿瘤抗原的识别，可以直接杀伤肿瘤细胞，但肿瘤局部的微环境包含大量的细胞因子，这些细胞因子可单独地或协同地影响CTL活化或肿瘤细胞对CTL杀伤的敏感性，共刺激免疫抑制性分子在这个过程中发挥重要的作用，它们要么使CD8+T细胞不能被活化，要么使活化的CD8⁺T细胞功能丧失或则使CD8⁺T细胞凋亡，这些共刺激免疫抑制性分子主要有：CTLA4/B7、PD-1/PD-L1、ICOS/B7-H2、BTLA/B7-H4、TIM3等。

PD-1分子2004年12月在第八届国际人类白细胞分化抗原会议上被命名为CD279。最早是通过削减杂交技术从小鼠处于凋亡状态的杂交瘤及造血祖细胞系克隆，被认为与细胞凋亡相关而命名为程序性死亡-1(programmed death-1)。它是免疫球蛋白超家族的激活诱导的抑制性受体，通过其胞浆区的两个酪氨酸残基与下游的信号分子作用而发挥对免疫应答的负性调控功能。PD-1分子可在淋巴样组织和实质器官组织部位双重抑制淋巴细胞的活化，在维持机体的外周耐受方面发挥重要的作用。研究表明，PD-1与其配体PD-L1(B7-H1)相互作用，组成PD-1/PD-L1通路，并且，PD-1/PD-L1通路可能参与了肿瘤免疫逃避、炎症、自身免疫性疾病、移植耐受和病毒感染等的发生过程。

申请人在分析CCR5结构的基础上以PD-1 IgV为研究目标，利用基因工程手段和蛋白质纯化技术，获得纯化的重组蛋白样品。外检测该融合蛋白体内能够与PD-L1结合，以融合蛋白对荷瘤小鼠进行抑瘤实验的观察。我们的发明进行了PD-1 IgV融合蛋白的实验基础研究，为进一步的肿瘤治疗提供了实验依据和奠定了基础。

1 Programmed death-1(PD-1)分子研究进展

1.1 PD-1的发现

PD-1分子2004年12月在第八届国际人类白细胞分化抗原会议上被命名为CD279。最早是通过削减杂交技术从小鼠处于凋亡状态的杂交瘤及造血祖细胞系克隆，被认为与细胞凋亡相关而命名为程序性死亡-1(programmed death-1)。它是免疫球蛋白超家族的激活诱导的抑制性受体，通过其胞浆区的两个酪氨酸残基与下游的信号分子作用而发挥对免疫应答的负性调控功能。PD-1分子可在淋巴样组织和实质器官组织部位双重抑制淋巴细胞的活化，在维持机体的外周耐受方面发挥重要的作用。研究表明，PD-1与其配体PD-L1(B7-H1)相互作用，组成PD-1/PD-L1通路，并且，PD-1/PD-L1通路可能参与了肿瘤免疫逃避、炎症、自身免疫性疾病、移植耐受和病毒感染等的发生过程。

1.2 PD-1的结构

PD-1分子相对分子质量是55,000免疫球蛋白超家族I型跨膜糖蛋白，共有288个氨基酸组成(氨基酸组成如下所示)。

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