[发明专利]鼠抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及鼠抗人T淋巴细胞CD₃表面抗原单克隆抗体及其制备方法和用途，属于生物技术领域。

背景技术

再生障碍性贫血(简称再障，AA)是由多种原因引起的骨髓造血功能衰竭性疾病，临床上呈全血细胞减少。近年来研究表明，免疫功能紊乱与再障的发病密切相关。已知某些病毒、药物及射线等因素与再障发病有关。随着经济建设的发展，环境生活因素的影响，我国再障的发病率逐渐增高，尤多发生于青壮年、婴幼儿，严重影响国民生产力及国民体质健康。再障分急性型(AAA)和慢性型(CAA)两类，又根据临床表现分为严重型(SAA)和极重型(VSAA)。SAA与VSAA发病急，进展快，易出现严重出血、感染，死亡率高。CAA以贫血为主，经常出血，反复感染，长期迁延不愈，部分患者输血要求频繁，CAA也可突然病情加剧，演变成SAA加速死亡。目前对再障的治疗还没有特效药物，再障至今被视为难治之症。

发明内容

本发明目的是通过杂交瘤技术，利用Balb/c小鼠以胎儿胸腺细胞进行免疫，用其脾细胞与SP2/0细胞融合筛选出一特异性单抗，即鼠抗人T淋巴细胞CD₃表面抗原单克隆抗体(简称抗CD₃单抗)。该抗体作为细胞免疫调节剂，在临床上可制成鼠抗人T淋巴细胞CD₃表面抗原单克隆抗体注射液(MMA₃)，主要用于治疗再障及其他细胞免疫功能紊乱性疾病，其疗效显著，副作用轻微，复发率低。

本发明采用的技术方案是：首先利用杂交瘤细胞技术以胎儿胸腺细胞作为免疫原，利用Balb/c小鼠进行免疫，制备杂交瘤细胞，即保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏号为CCTCC NO：C200803的抗T淋巴细胞单克隆抗体杂交瘤细胞株CD3。然后将该杂交瘤细胞注射入Balb/c小鼠体内，抽取腹水产生鼠抗人T淋巴细胞CD₃表面抗原单克隆抗体。

本发明涉及到的杂交瘤细胞已于2008年3月14日保存于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保存号为：C200803，名称为抗T淋巴细胞单克隆抗体杂交瘤细胞株CD3。

本发明是通过以下过程实现的：

一、杂交瘤细胞CCTCC NO：C200803的产生

1、制备免疫原在超净台内无菌条件下取胎儿胸腺细胞作为免疫原。

2、免疫第一次免疫用2×10⁷胸腺细胞，腹腔注射，加强免疫二次，每次间隔3周，融合前3天做末次免疫。

3、融合与克隆化Balb/c小鼠经胎儿胸腺细胞腹腔注射免疫后，取脾细胞与Sp2/0细胞与50％PEG作用下融合后，置HAT选择培养基中培养，加Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞，5天后可见集落长成，10-12天后换HT培养液，待集落生长至孔面积1/4左右时，取上清以APAAP法进行细胞株筛选，得到抗体分泌阳性的杂交瘤细胞即抗T淋巴细胞单克隆抗体杂交瘤细胞株CD3。

二、由上述杂交瘤细胞CCTCC NO：C200803分泌的鼠抗人T淋巴细胞CD₃表面抗原单克隆抗体的制备通过以下步骤实现的：

(1)预注射液体石蜡

用酒精棉球消毒小鼠腹部皮肤，每只腹腔注射0.5ml石蜡；

(2)细胞扩培

将获得的杂交瘤细胞CCTCC NO：C200803接种到培养瓶中孵箱培养扩增，收集细胞；

(3)接种细胞

将上步收集到的细胞用生理盐水稀释调至1×10⁶-3×10⁶个/ml，每只小鼠腹腔注射0.5ml；

(4)采集腹水

挑出接种细胞后7-12天的小鼠抽腹水；腹水经澄清、分子筛柱层析纯化后即可获得鼠抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体。

上述步骤获得的鼠抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体可进一步制成鼠抗人T淋巴细胞CD₃表面抗原单克隆抗体注射液(MMA₃)，临床上主要用于治疗再生障碍性贫血。

本发明临床前研究：

1.药效学研究表明，MMA₃对PBMNC无致丝裂作用，对无造血系统疾病者的骨髓CFU-GM及再生障碍性贫血患者骨髓CFU-CM的体外生长有明显激活作用，并呈双向作用。

2.药理学研究表明，在高于临床拟用剂量条件下，MMA₃对猫的精神神系统以及血压、呼吸、心电等均无影响。