[发明专利]一种交叉保护性疫苗抗原及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学以及基因工程领域，具体的说是一种交叉保护 性疫苗抗原及其制备方法和应用。

背景技术

弧菌属为革兰氏阴性杆菌，广泛分布于世界各地，尤其是海洋环境中。 该属包括多种人类和养殖水生生物病原菌，如霍乱弧菌，副溶血弧菌，创 伤弧菌，哈氏弧菌等。其中哈氏弧菌(Vibrio harveyi)长期以来为虾类 重要病原菌，其感染和传播给我国养虾业造成巨大经济损失。除虾以外， 哈氏弧菌还能够感染多种鱼和贝等；最近调查研究表明，该菌近几年来已 成为危害我国，尤其是北方，海水养殖业发展的主要病原之一。副溶血弧 菌(V.parahaemolyticus)为重要人类病原菌，同时亦能感染多种养殖水 生生物，包括鱼、虾、贝和蟹等。

目前对于这些病原性细菌病的防治主要依赖于抗生素(包括各种化学药 物)和疫苗免疫两条途径。虽然人类医学史的发展已证明疫苗免疫为最有 效的疾病预防措施，然而对于我国水产养殖业而言由于起步较晚，基础研 究相对落后于生产发展等原因，养殖水生生物病害的免疫防治仍是一个亟 待解决的问题。目前国际上应用和尝试应用于水产业的疫苗可分为灭活全 菌疫苗、减毒疫苗、重组蛋白疫苗和基因疫苗等几大类。灭活疫苗虽然安 全但往往由于抗原成分和结构在制备过程中被部分破坏而免疫效应较差； 减毒疫苗虽然免疫效应强但由于是活菌因而具有一定的潜在性安全隐患； 相对而言重组蛋白和基因疫苗在安全性和稳定性上都具有优势，其实际应 用价值只受限于其免疫保护效应和传递手段。因而筛选和获得具高效免疫 效应的抗原是重组蛋白疫苗构建的关键。另外，由于水产养殖生物病原的 多样性和多变性，针对单一病原的特异性疫苗已不能满足产业要求，而对 多种不同病原皆具保护效应的交叉疫苗则由于其更大的实际应用价值而成 为将来疫苗发展的趋势。

发明内容

本发明目的在于提供一种交叉保护性疫苗抗原及其制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

交叉保护性疫苗抗原：具有序列表SEQ ID No.1中的碱基序列。

抗原制备方法：1)质粒pET258构建：将经BglII/NdeI双酶切的质粒 pET25回收的104bp片段与经BglII/NdeI双酶切的质粒pET28回收的5.3kb 片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌中并在含安卡青霉素的 LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为pET258；

2)质粒pEVQ构建：

a.以哈氏弧菌T4为模板，用引物VHQF5 5’-CATATGGCGCTTCCACTCAGTGTGG -3’，VHQR55’-CTCGAGGCGGATAACGAGGTAAACC-3’，进行PCR扩增，产物 纯化后与载体pBS-T于室温连接2-8小时，连接混合液转化大肠杆菌后在含 安卡青霉素、Xgal、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB培养基上培养18-24 小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒pBTQ；

其中所述哈氏弧菌T4于2007年3月22日保存于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.1985，分类命 名：哈氏弧菌，拉丁名称：harveyi；

b.将步骤a)的质粒pBTQ用限制性内切酶NdeI/XhoI双酶切后电泳， 回收1.3kb DNA片段，将其与步骤1)的质粒pET258连接，转化入大肠杆菌， 在含有Kn的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为质 粒pEVQ；

3)质粒pEVQ的诱导表达：将步骤2)的质粒pEVQ转化入大肠杆菌中， 在含有Kn的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子即为BL21/pETQ，将 BL21/pETQ于含有Kn的LB培养基中过夜培养；而后再将培养液加入到新鲜 的含有Kn的LB液体培养基中，于37℃摇动培养至OD₆₀₀为0.6，加入终浓度 为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，37℃继续摇动培养4-5小时，裂解菌 体，离心收集上清，纯化重组蛋白，即为具有序列表SEQ ID No1中的碱基序 列的重组交叉保护性疫苗抗原VhdQ；

其中：培养液与新鲜的含有Kn的LB液体培养基体积比为1∶100。