[发明专利]一种大豆异黄酮苷制备其苷元的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备大豆异黄酮苷元的方法，尤其是一种从雉科动物家鸡的干燥砂囊内膜的鸡内金中提取出鸡内金酶，以鸡内金酶水解大豆异黄酮苷糖基制备其苷元的方法。

背景技术

大豆异黄酮是一种含有芳香环的非类固醇化合物，迄今为止从大豆中共分离出12种大豆异黄酮异构体，分为结合型的糖苷和游离型的苷元两类，结合型糖苷主要有染料木苷、大豆苷和黄豆苷等九种形式；苷元包括染料木素、大豆素和黄豆黄素三种形式。此12种大豆异黄酮异构体因其母环特定位置上基团的不同而具有不同的名称。本发明下文提及的染料木苷、大豆苷和黄豆苷均为大豆异黄酮异构体形式之一，本发明统称为大豆异黄酮苷；而染料木素、大豆素和黄豆黄素为染料木苷、大豆苷和黄豆苷被水解掉糖基后所对应的相应形式的苷元，发明统称为大豆异黄酮苷元。

大豆中约有50％～60％的异黄酮为染料木苷，染料木苷及其苷元染料木素是目前研究比较多的一种大豆异黄酮成分。大豆异黄酮属植物雌激素，是一类重要的生理活性物质，许多研究表明大豆皂苷具有多种生理活性和良好的药理作用，如抗癌，调节免疫能力，防止心血管疾病，降血压，降低血清中胆固醇含量，以及抗血栓等作用，主要应用于医药、保健及化妆品等领域。

近年来的研究发现，大豆异黄酮苷中的糖基与其生物活性之间有着密切的联系。大豆异黄酮苷元的雌激素受体活性比带糖基的大豆异黄酮糖苷高至少倍30倍。但目前市售的大豆异黄酮多是带糖基的糖苷型，其活性较低。对于如何将大豆异黄酮糖苷的糖基去掉，使其转化为高活性的苷元，国内外都进行了较多的研究。

申请号为200710029119.1的中国专利申请公开了一种大豆异黄酮的制备方法，该专利申请利用盐酸-乙醇回流水解的方法水解大豆异黄酮苷糖基，然而酸碱水解法存在对苷元破坏性大，污染大，目的性差的缺点。

专利号为ZL 03133637X的中国专利公开了用微生物发酵的方法水解大豆异黄酮苷糖基的方法，其水解酶来源于微生物发酵，转化率为50～80％。

通过微生物发酵法产大豆异黄酮糖苷酶，成本较低，但其酶活力普遍不高，且操作繁琐。

发明内容

本发明为了克服现有技术所存在的技术问题，提供了一种操作简单、成本低廉而转化率高的鸡内金酶水解大豆异黄酮苷的糖基制备其苷元的方法。

本发明是这样实现的：

(1)鸡内金酶的制取：

(a)鸡内金用不锈钢粉碎机粉碎成小于20目的颗粒成鸡内金粉；

(b)用磷酸或醋酸缓冲液浸提(a)的产物，磷酸或醋酸缓冲液浓度为0.2M/L，pH在3.0～7.0范围，(a)的产物与磷酸或醋酸缓冲液按1:3～10的质量比混匀，在4℃浸提3～36h；离心弃渣，得上清液；

(c)往(b)的产物中添加硫酸铵至饱和或过饱和以沉淀鸡内金酶蛋白，硫酸铵浓度为35～70％；离心弃去清液，得到鸡内金酶蛋白；

(d)用磷酸或醋酸缓冲溶液溶解(c)的产物，磷酸或醋酸缓冲溶液浓度为0.2M/L，pH为3.0～7.0，(c)的产物与磷酸或醋酸缓冲溶液按1:3～5的质量比混匀；用玻璃纸袋透析除去硫酸铵，离心弃渣，即得鸡内金酶液；

(2)大豆异黄酮苷元的制备：

(e)大豆异黄酮苷用磷酸或醋酸缓冲液配制成1～100g/L的工作液；磷酸或醋酸缓冲溶液浓度为0.2M/L，pH为3.0～7.0；

(f)将(d)和(e)的产物混匀后进行酶反应，酶反应条件为温度为10～40℃，反应时间为3～30h，(d)与(e)的产物比例为1：0.5～5；

(g)在(f)步骤反应终止后，加入乙酸乙酯，(g)的体积与乙酸乙酯比例为1：1～3；采用机械震荡或人工震荡，充分震荡萃取，静置分层，上层即为制得的大豆异黄酮苷元乙酸乙酯溶液；萃取2次，分别合并上层和下层；上层乙酸乙酯通过蒸发回收后再次投入使用；下层磷酸或醋酸缓冲溶液通过浓缩可以回收再次投入使用；

(h)浓缩(g)的产物即为大豆异黄酮苷元，大豆异黄酮苷转化率可达到60～97％。

本发明可用乙醇或硫酸铵两种方法收集鸡内金蛋白。如果用乙醇沉淀鸡内金酶蛋白时，上述(c)步骤中加入上清液3～6倍的95％的乙醇以沉淀鸡内金酶蛋白；由于沉淀不用硫酸铵，所以在(d)步骤中就无需透析除去硫酸铵了。

实践证明，以下为较佳的实践方式：