[发明专利]一种超抗原活性增强的SEC2突变基因及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术，具体说是一种超抗原活性增强的SEC2突变基因及其制备方法。

背景技术

超抗原(superantigen，SAg)是一组由细菌或病毒编码的蛋白质分子，其不需要抗原递呈细胞(APC)的加工，而以完整蛋白质形式直接与细胞膜上的MHC II分子结合形成复合物，在极低浓度(1～10ng/ml)即可刺激大量具有特异性Vβ的T细胞增殖，从而引发极强的机体免疫反应并产生一定的抗肿瘤活性。因此，超抗原作为一种理想的免疫调节剂和增效剂，有望开发成一种有效的新型抗肿瘤药物，用于肿瘤治疗。

金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxins，SEs)是一类具有代表性的细菌外毒素。由于其极强的T细胞激活功能，成为一类典型微生物超抗原，受到人们的广泛重视。近年来，人们对金黄色葡萄球菌肠毒素(SE)在免疫学功能及抗肿瘤应用等方面进行了许多基础和临床研究工作，得到了令人鼓舞的结果，但其主要集中于SEA、SEB等。而SEC2作为金黄色葡萄球菌肠毒素家族中的一员，国内外对其在抗肿瘤方面的研究还比较少。我所首次对SEC2的基因进行了克隆、测序并在靶向融合蛋白研究方面进行了有意义的尝试，为进一步开展肠毒素C2(SEC2)分子改造及其靶向融合蛋白的研发奠定了基础。

已有的研究表明，由于金黄色葡萄球菌肠毒素属于一种细菌内毒素，因此在一定浓度条件下会引起食物中毒和毒素综合症，从而导致发烧、呕吐、休克等症状，在一定程度上限制了金黄色葡萄球菌肠毒素在临床抗肿瘤治疗中的剂量使用范围，影响了治疗效果。此外，近年的研究显示超抗原SEA和SEB在体内和体外实验中均能产生免疫抑制效应，高剂量的使用和重复给药均会导致T细胞的失活和凋亡。而最近的研究显示SEC也可以诱导产生免疫抑制效应，且免疫抑制效应与剂量和时间呈一定的依赖关系，高剂量的SEC会导致免疫抑制，引起T淋巴细胞无能，从而导致抗肿瘤活性降低。总之，金葡菌肠毒素所具有的内毒素活性和免疫抑制效应在一定程度上限制了其在临床抗肿瘤治疗中的剂量使用范围，影响了抗肿瘤免疫治疗的效果。因此，很有必要通过基因工程手段从根本上提高肠毒素的超抗原活性和抗肿瘤效应，使其在极低浓度条件下即可产生强大的抗肿瘤免疫效应，在一定程度上弥补在临床抗肿瘤免疫治疗中由肠毒素本身所引起的边缘效应。

由于超抗原诱导的免疫效应是通过与MHC II分子和TCR-Vβ相互作用而实现的，因此通过改变超抗原与以上两者的亲和力而提高超抗原活性就成为了可能。然而，由于人体某些正常组织也会表达MHC II分子，因此超抗原诱导的细胞毒作用通常对这类正常细胞也会产生一定的损伤，所以通过增强肠毒素与MHC II分子的亲和力而提高超抗原活性显然不是一条可行的途径。而通过改变肠毒素超抗原与TCR的亲和力而提高超抗原活性，进而增强抗肿瘤效应则是可能的。

发明内容

为了进一步提高金黄色葡萄球菌肠毒素的超抗原和抗肿瘤活性，在一定程度上弥补其在临床抗肿瘤应用中所存在的缺陷，本发明提供一种超抗原活性增强的SEC2突变基因及其制备方法

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

超抗原活性增强的SEC2突变基因，具有序列表SEQ ID NO：1中的碱基序列。

超抗原活性增强的SEC2突变基因的编码蛋白，具有序列表SEQ ID NO：2中的氨基酸序列。

超抗原活性增强的SEC2突变基因的制备方法：

1)制备超抗原活性增强的SEC2突变基因：以重组质粒pET-28-TM-sec2为模板，分别采用引物对1和引物对2进行左右重叠PCR扩增，而后以左右重叠PCR产物为模板，以引物对3为引物进行重叠PCR；而后再以扩增产物为模板，以引物对4为引物再进行PCR扩增，即得超抗原活性增强的突变基因SEC2(T20L/G22E)；

引物对1为，R-Mutant，5’-TATTTTCCATCAAACCAGTAAACTCACTTG-3’和TM-F，5’-CGGAATTCGCCGAGCAGAGAGC-3’；

引物对2为F-Mutant，5’-GTTTACTGGTTTGATGGAAAATATGAAATAT-3’；和SEC2-R，5’-TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’；

引物对3为TM-F，5’-CGGAATTCGCCGAGCAGAGAGC-3’和SEC2-R，5’-TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’；