[发明专利]重组CREG蛋白及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种携带人E1A激活基因阻遏子(hCREG)基因的真核表达载体及一种携带糖基化位点突变的hCREG基因的真核表达载体，本发明还涉及所述真核表达载体用于制备重组hCREG蛋白及糖基化位点突变的hCREG蛋白，两种蛋白抑制血管平滑肌细胞(vascular smoothmuscle cells，VSMCs)增殖的作用及用于制备对PCI术后再狭窄具有抑制作用的药物及其用途。 

背景技术

蛋白质糖基化是真核生物蛋白质翻译后修饰的重要方式，生物体内大约50％的蛋白质都是糖基化蛋白，包括酶、载体蛋白、激素、毒素、各种凝集素和结构蛋白。糖基化蛋白中的蛋白质是其生理功能的主要承担者，而糖链则通过识别和调控作用直接影响蛋白质的整体构象，进而影响由构象决定的蛋白质的生物学功能。由于多糖分子自身存在的高可变性，使得由不同宿主细胞、不同培养条件以及不同纯化工艺所制备的重组糖蛋白的糖基形式存在显著差异。这种糖基化形式的变异对糖蛋白正常的理化性质和生物学功能都存在严重的影响，从而制约了重组糖蛋白工程的发展。 

人CREG(human cellular repressor of E1A-stimulated gene，hCREG)基因是1998年哈佛医学院Gill克隆的一个细胞分化调控基因(Veal E，Mol Cell Biol，1998；18(9)：5032-5041)。本室前期研究证实，hCREG蛋白表达能明显抑制体外培养的人胸廓内动脉平滑肌细胞-HITASY的增殖并促进其分化(Han Ya-Ling，Chinese Journalof Cellular and Molecular Immunology，2005；21(5)：570-574；HanYa-Ling，Prog Biochem Biophys，2004；31(12)：1099-1105；Han Ya-Ling，Prog Biochem Biophys，2005；32(6)：517-522)。同时，经外膜包裹导入的pLNCX2-hCREG逆转录病毒有效抑制了球囊拉伤后小鼠颈动脉狭窄的发生(Han Ya-Ling，Chinese Journal ofPathophysiology(already accepted，to be published))。Veal等的研究发现hCREG为分泌型糖蛋白，其蛋白结构中含有三个N-连接的糖链，可与细胞膜胰岛素样生长因子受体2(IGF2R)的6-磷酸甘露糖(M6P)配基结合，通过自分泌和旁分泌发挥其生物学功能(Veal E，Oncogene，2000；19(17)：2120-2128)。上述研究提示，hCREG糖蛋白可能是诱导VSMCs分化的重要调控因子，在临床经皮腔内冠状动脉介入治疗术后再狭窄的防治研究中具有潜在意义。 

作为分泌型糖蛋白，hCREG蛋白合成过程中进行正确的糖基化修饰是其具有正常结构和功能的保证。据文献报道，CREG诱导的细胞生长抑制依赖于M6P/IGF2R，M6P/IGF2R优先与糖基化的CREG结合，只有极少量与非糖基化的CREG结合(Alessandra Di Bacco，Oncogene，2003；22(35)：5436-5445)。 

为准确表达重组hCREG糖蛋白的结构和功能，本研究构建了pcDNA3.1myc-His/hCREG真核表达载体及糖基化位点突变的pcDNA3.1myc-His/hCREG真核表达载体，并选择了外源性蛋白的人胚胎肾工程细胞系293F进行重组hCREG/myc-His融合蛋白及糖基化位点突变的融合蛋白的表达。两种蛋白可用于比较CREG的糖基化形式对其功能的影响。糖基化的CREG蛋白能够最大限度地发挥其生物学功能；同时，具有生物学功能的去糖基CREG蛋白也可应用原核表达载体制备，满足大量生产的要求，从而克服糖基化的CREG蛋白必须应用真核表达载体制备及产量较低的不足。 

发明内容

本发明的一个方面，涉及一种携带人E1A激活基因阻遏子(hCREG)基因的真核表达载体及一种携带糖基化位点突变的hCREG基因的真核表达载体，在本发明中，所述CREG基因是指人CREG基因，其序列如 SEQ ID NO：1所示(参见GenBank登录号NM003851)，糖基化位点突变的CREG指第160、193、216位点氨基酸序列由N突变为A，此序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。真核表达载体为pcDNA3.1 myc-His(美国Invitrogen公司)。