[发明专利]不具有海藻糖的生产氨基酸的方法

说明书

本申请是中国专利申请200380107413.X的分案申请，原申请的申请日是2003年12月19日，发明名称是“不具有海藻糖的生产氨基酸的方法”。

技术领域

对可获得的谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)基因组序列数据的分析导致提出细菌中存在所有三个已知的海藻糖生物合成途径，即从UDP-葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸(OtsA-OtsB途径)、从malto-寡糖或α-1，4-葡聚糖(TreY-TreZ途径)、或从麦芽糖(TreS途径)合成海藻糖。通过染色体缺失失活三条途径中的仅一条，不会对谷氨酸棒杆菌的生长造成严重的影响，而同时失活OtsA-OtsB和TreY-TreZ途径或所有三条途径导致相应突变体不能合成海藻糖，并且不能在含有多种糖底物的基本培养基中有效生长。通过向培养肉汤中加入海藻糖，这种生长缺陷可很大程度地得到逆转。

另外，发现了涉及糖原合酶(GlgA)的从ADP-葡萄糖合成糖原的可能途径。当在糖过量的条件下生长时，发现谷氨酸棒杆菌积聚大量的糖原。染色体glgA基因的插入失活，导致谷氨酸棒杆菌细胞不能积聚糖原，并废除了otsAB背景中的海藻糖合成，这表明通过TreY-TreZ途径产生海藻糖依赖于功能性的糖原生物合成途径。

当在缺乏海藻糖的基本肉汤中生长时，具有失活的OtsA-OtsB和TreY-TreZ途径、不产生海藻糖的突变体，显示出改变的细胞壁脂类组成。在这些条件下，突变体在其细胞壁脂类部分同时缺乏主要的含海藻糖的糖脂，即海藻糖棒杆菌分枝菌酸单酯(monocorynomycolate)(TMCM)和海藻糖棒杆菌分枝菌酸二酯(dicorynomycolate)(TDCM)。我们的结果表明，海藻糖含量少的谷氨酸棒杆菌突变体的细胞壁脂双层的显著改变，可能是在基本培养基中观察到该株生长缺陷的原因。此处报道的谷氨酸棒杆菌中海藻糖生物合成的遗传和生理学剖析的结果，可能与含分枝菌酸的棒状杆菌的全部系统发育组普遍相关。

背景技术

谷氨酸棒杆菌是革兰氏阳性土壤菌，其最初以它可产生和分泌谷氨酸的能力而分离(Kinoshita等.1957)。现在，使用这种微生物遗传改进菌株的工业氨基酸生产方法，用于满足正在增长的氨基酸全球市场，尤其是L-谷氨酸和L-赖氨酸。

在细菌的分类系统中，棒杆菌属和分枝杆菌属、诺卡氏菌属、红球菌属和一些相关的分类单位属于含有分枝菌酸的放线菌群。这些属也是系统发育上相关的。对于革兰氏阳性菌而言不同寻常的是，它们的细胞壁在质膜外含有特征性的疏水层。据显示，该层在棒杆菌的药物和底物渗透性中扮演重要角色。与外层由磷脂和脂多糖组成的革兰氏阴性菌相反，棒杆菌和相关分类单位的外部脂类层的主要成分是分枝菌酸酯。最近显示，棒杆菌细胞的外部疏水屏障表示由与细胞壁供价连接的分枝杆菌酸(mycolate)和非共价连接的糖脂共同组成的脂双层。两个含有海藻糖的棒杆菌分枝杆菌酸酯，即海藻糖棒杆菌分枝菌酸单酯(TMCM)和海藻糖棒杆菌分枝菌酸二酯(TDCM)是该脂双层的主要游离脂类部分。谷氨酸棒杆菌中海藻糖的存在并不仅限于这两个结构成分。作为对高渗压力的反应，在谷氨酸棒杆菌中观察到大量的游离海藻糖。另外，在过量生产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌ATCC 21253株的发酵期间，发现海藻糖是分泌至生长培养基中的副产物之一。

从细菌至植物、昆虫和哺乳动物，已在多种原核和真核生物中发现海藻糖(α-D-吡喃葡萄糖基-α-D-吡喃葡萄糖甙)——广泛分布于自然界的非还原性二糖。海藻糖的生物学角色在不同生物中变化极大。当在细菌中时，它可作为碳源(大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis))、或在渗透压休克条件下作为可混溶溶质被合成(大肠杆菌)，或扮演结构角色(棒状杆菌科(corynebacteriaceae))。在酵母和丝状真菌中，海藻糖主要作为储备碳水化合物或针对不同压力因素的保护者而贮藏于胞内。在昆虫的一些物种中，积聚海藻糖作为在飞行期间可迅速使用的糖源而被积聚。