[发明专利]具有优化的5’端前导功能（5’-UTR）的人工DNA序列用以改进异源蛋白质在植物内的表达

说明书

发明领域

本发明涉及用以改善异源蛋白质在植物中表达的人工DNA序列。

发明背景

在生物技术领域内，对于提高引入相关生物的基因的表达水平有着强 烈的需求。这一表达水平往往并不能令人满意，并成为植物和动物生物技 术中的创新付诸工业应用的障碍。有大量数据显示了前导区在调控基因表 达水平中的重要性，同时有多种结构元件来表征其调控能力。

在此情况中，如同对于广泛普及的载体(例如pBI121及其衍生物、 pCAMBIA及其衍生物)所提出的，5’端的非翻译前导序列(5’-UTR)存 在着大量的缺陷，使其不适合指导基因修饰的生物体内足够水平的基因表 达。特别是，想要最大化产量时(例如利用植物作为细胞工厂生产对人有 用的化合物)，必须消除5’-UTR序列产生的产量限制。为此，已提议将 前导序列Ω(自然存在于烟草花叶病毒TMV中的序列)用于植物中。然 而，这也有缺陷和冗余之处，使其有待改善。

人们已知存在于TMV前导序列Ω中的翻译增强子中的多聚(CAA)区 域(Gallie和Walbot 1992 Nucleic Acids Res.，20，4631-4638)显著提高表 达水平，也就是说，它对异源蛋白质在体外和体内的翻译水平有积极的影 响(Gallie等人，1988a Nucleic Acids Res.，16，883-893，Gallie等人，1988b Nucleic Acids Res.，16，8675-8694，Gallie 2002 Nucleic Acids Res.，30， 3401-3411)。在前导序列Ω中，多聚(CAA)序列与三个ACAATTAC重 复序列相连(Gallie等人，1988a)，但缺失研究表明，负责提高表达水平 的调控元件可能包含与基序(CAA)n组合的单拷贝ACAATTAC序列 (Gallie和Walbot 1992)。

人们还知道，CaMV 35S启动子的转录起始位点(Inr)有助于mRNA 的有效加帽(Guilley等人，1982 Cell，30，763-773)。

此外，人们已知许多植物前导序列(Bolle等人，1996 Plant Mol.Biol. 32，861-868)具有富含CT元件的序列，并且该富含CT元件的序列可以 改变转录水平(Chen等人，1996 J.Virol.，70，8411-8421)。

人们还知道，长度超过40个核苷酸的序列易于识别第一个AUG作为 真正的起始翻译密码子(Kozak 1989J.Cell.Biol.，108，229-241)。例如， 已观察到，将前导区从29个核苷酸延长至74个核苷酸导致mRNA在体外 (Kozak 1991，J.Biol.Chem.，266，19867-19870)和体内(Gallie和Walbot 1992)翻译水平的增加。前导序列的A/T含量越高导致表达水平越高，原 因是阻碍了由于分子自身折叠而导致的双链mRNA片段的形成。事实上， 可以肯定这种二级结构对翻译效率具有不利影响(Pelletier和Sonenberg 1985 Cell，40，515-526；Kozak 1986 Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83， 2850-2854)。此外，已注意到，源自病毒的5’-UTR的部分向植物前导区 中的引入可以由报道蛋白表达水平的增加反映出来(Dowson Day等人， 1993 Plant Mol.Biol.，23，97-109)。

因此本发明的目的在于弥补本领域现状的缺陷，并获得增加植物中重 组蛋白表达水平的前导序列。

本申请的申请人设计、测试并具体实施了本发明以克服本领域现状中 的缺点并达到这些以及其他目的和优势。

发明概述

独立权利要求阐述并表征了本发明，而从属权利要求描述本发明的其 他特征或主要发明的想法的变型。

按照上述目的，根据本发明的具有5’端前导功能(5’-UTR)的人工 DNA序列(以下用LL-TCK表示)同时包含有利基因表达的元件，如重 复的CAA三核苷酸元件，其与重复的CT二核苷酸元件组合。

根据本发明的LL-TCK序列是通过人工合成的方法获得的，是智慧的 结晶，因为它不是天然存在的。