[发明专利]低出血抗凝血融合蛋白的制备及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一类低出血抗凝血物质的结 构和制备方法及其在防治血栓性疾病和血栓相关性疾病中的应 用。具体而言，本发明涉及抗凝血物质与能被数个凝血因子(包 括凝血酶、凝血因子Xa(FXa)、凝血因子XIa(FXIa)等)识别 并裂解的氨基酸序列连接而成的新物质，以及这些新物质的制备 和医药学用途。

背景技术

心脑血管疾病是近年来威胁人类健康和生命的头号杀手，血 栓形成是许多心脑血管疾病的重要诱因，抗凝剂是防治血栓形成 的重要药物。目前临床上广泛应用的抗凝剂主要是肝素，肝素的 一个重要缺点是引发血小板减少症(thrombocytopenia)。现在 又发展的低分子量肝素可以减轻肝素应用中的风险程度，但不能 根本克服它的缺点。水蛭素是近年来欧洲已经上市的一个新型抗 凝药物，它是凝血酶的直接抑制剂，但它对凝血酶的强抑制作用， 可导致凝血相关参数，如出血时间、APTT、TT和PT等急剧升高， 从而伴有全身或系统性出血风险。

现有抗凝药物存在的上述问题已经越来越多的受到人们的关 注，作为一个理想的抗凝药物，在全身用药条件下，应当具有明 确的抗凝抗栓效果，但又不引起出血副作用，使临床用药安全性 提高。

为此，本发明思想的指导原则的关键是使抗凝剂的抗凝活性 进行条件特异性释放，即在正常条件下，该类物质无抗凝活性， 而当凝血系统被激活，有血栓形成可能或有血栓形成时，该类物 质的抗凝活性才在该局部释放，营造不易形成血栓的微环境(即 在局部出现抗凝活性)，防止血栓形成或已有血栓的继续增长， 甚至溶解已形成的微小栓子以达到防治血栓形成的功能。这就克 服了肝素、水蛭素等抗凝剂用药引起系统性出血的风险。

例如水蛭素是由65～66个氨基酸组成的单链多肽。其氨基端 可以与凝血酶催化活性位点结合，具有抗凝活性，羧基端与凝血 酶的底物识别位点结合，对凝血酶有很强的特异性亲和作用。本 文设计了一个封闭水蛭素氨基末端的措施，以达到暂时封闭水蛭 素的抗凝活性的目的。当体内凝血系统被激活发生血栓时，利用 血栓发生过程中引发的生物化学变化的特点，使氨基末端被封闭 的水蛭素重新回复为水蛭素原形，在可能发生或已发生的血栓的 局部发挥特异性抗凝作用，从而降低水蛭素引起系统性出血的危 险，成为一类新型的、安全的、有效的抗凝剂。

在上述发明思想的指导下，本文对水蛭素进行了修饰。由于 本实验室曾在水蛭素的氨基末端连接上可被凝血酶识别并裂解的 寡肽(该水蛭素衍生物命名为TH)或凝血因子Xa识别并裂解的 寡肽(该水蛭素衍生物命名为FH)，以便一旦凝血系统被激活，则 释放水蛭素的抗凝活性，起到抗凝和抗栓作用，且减少出血副作 用。结果表明是有一定作用，但是效果还差。因此我们进而改变 思路，考虑采取连接可被数个凝血因子或其它凝血因子识别并裂 解的寡肽进行修饰，希望可以提高效果，达到具有实际应用的目 的。当然这些寡肽在血栓发生时能否高效率地被相应的凝血因子 识别并裂解，根据有关文献看来目前并无法推测。本实验室就试 验制备了两个相关蛋白：①水蛭素的氨基末端连接上可被凝血酶 和凝血因子Xa分别识别并裂解的寡肽，该水蛭素衍生物命名为 GH；②水蛭素的氨基末端连接上可被凝血因子XIa和凝血因子Xa 分别识别并裂解的寡肽，该水蛭素衍生物命名为EH。结果表明该 两个水蛭素衍生物在体外和体内正常情况下不具有抗凝活性，一 旦体内凝血系统被激活，则在以上凝血因子的共同作用下，可高 效地局部释放水蛭素的抗凝活性，起到抗凝和抗栓作用。当然， 在体内不存在血栓的部位，则无抗凝活性，故其出血副作用也显 著降低。因此，它不同于水蛭素、肝素等抗凝剂，是一类安全、 有效的抗凝抗栓剂。从而，此类具有低出血特征的抗凝剂对于防 治血栓形成的应用具有重要意义。

发明目的

本发明的目的在于提供一类本身无抗凝活性，而当有血栓发 生倾向或血栓发生时，可以在发生血栓局部释放其抗凝活性，从 而防治血栓形成的物质。

发明内容