[发明专利]脂解酶变体

说明书

发明领域

本发明涉及具有脂解酶(lipolytic enzyme)活性的多肽和制备该多肽的 方法。

发明背景

WO8802775描述了南极念珠菌(Candida antarctica)脂肪酶B(CALB)。 Uppenberg，Hansen，Patkar，Jones，Structure 2，293-308(1994)描述了CALB 的氨基酸序列和三维(3D)结构。所述3D结构可以在Research Collaboratory 的Structural Bioinformatics Protein Data Bank(结构生物信息学蛋白质数据 库)(RCBS PDB)(http://www.rcsb.org/)中找到，其识别号为1TCA。

CALB变体在Zhang等Prot.Eng.2003，16，599-605；Lutz.2004， Tetrahedron：Asymmetry，15，2743-2748；Qian和Lutz，JACS，2005，127， 13466-13467；和WO 2004/024954中描述。

WO9324619描述了来自Hyphozyma属菌种的脂肪酶。其它脂肪酶的 氨基酸序列可以在UniProt [the Universal Protein Resource(通用蛋白质资 源)]中使用登录号Q4pep1、Q7RYD2、Q2UE03、Q4WG73、Q6BVP4和 Q4HUY1找到。

发明内容

发明人对1TCA结构进行了分子动力学(MD)模拟。所述分析揭示出两 种迄今未知的具有显著移动性(mobility)的盖(lids)，Lid 1由第135或136至 第155或160残基组成，而Lid 2由第267-295残基组成。所述模拟指出了 在水溶液中更类似于闭合的形式和在有机溶液中更充分开放(open)的形式。 所述分析揭示了3D结构中影响所述脂肪酶的活性和功能性的重要区域，而 发明人将这用于设计脂解酶变体，其具有增加的比活性，尤其是针对大型底 物(bulky substrate)(例如分支的酸或长链脂肪酸和/或仲醇的酯)和/或在高pH 增加的活性(较高的最适pH)和/或增加的对映选择性(enantioselectivity)。

另外，以CALB与一些同源脂肪酶序列的比对为基础，发明人已经选 择了氨基酸残基并且设计了脂解酶变体。

因此，本发明提供一种制备多肽的方法，其包括：

a)选择亲本多肽，该亲本多肽具有脂解酶活性并具有与CALB(SEQ ID NO：1)有至少30％同一性的氨基酸序列，

b)在所述序列中选择对应于CALB(SEQ ID NO：1)的残基1、13、25、 38-51、53-55、58、69-79、91、92、96、97、99、103、104-110、113、132-168、 173、187-193、197-205、215、223-231、242、244、256、259、261-298、 303、305、308-313或315中任何的一个或多个氨基酸残基，

c)改变所选氨基酸序列，其中所述改变包含取代或缺失所选残基或插 入至少一个残基使其与所选残基相邻(insertion of at least one residue adj acent to the selected residue)，

d)制备具有改变的氨基酸序列的改变的多肽，

e)测定改变的多肽的脂解酶活性或对羧酸酯键的对映选择性，和

f)选择与亲本多肽相比具有更高脂解酶活性或更高对映选择性的改变 的多肽。

本发明还提供多肽，所述多肽：

a)具有脂解酶活性，和