[发明专利]新型线虫蛋白质及其在生产抗蠕虫药和疫苗中的应用

说明书

发明领域

本发明涉及用于鉴定新型抗蠕虫药的筛选，特别涉及抗血矛线虫属蠕 虫的药剂，以及用作针对蠕虫如血矛线虫属(haemonchus)蠕虫的疫苗或免 疫原性药剂的蛋白/肽的制备。

发明背景

蠕虫寄生虫引起宽范围的家畜动物的疾病和感染，当它们导致疾病和 感染时，其导致生产力丧失并且甚至导致动物死亡，因此有相当大的经济 重要性。

食血(blood feeding)线虫类血矛线虫属感染反刍动物的胃肠道内层。 它在世界范围内具有非常值得考虑的经济重要性，具有从家畜动物的体重 增加的减少、生产力丧失和缺乳到死亡范围内的影响。贫血是感染的基本 特征。当大量幼虫感染绵羊时，在绵羊仍然看起来是健康的时候可能突然 发生死亡。这称为“急性潜伏期病”，此时用粪便检查看不到卵。包括较 少量蠕虫的慢性感染可能引起水肿(下颌水肿)，缺铁性贫血症，进展性 虚弱，毛发断裂(wool breaks)，和死亡。四阶段幼虫和成虫都刺穿胃壁 中的血管，并且以所释放的血液为生。因此，宿主利用营养来替换失去的 血液成分，而不是用于生长和毛发生产。一种相关的线虫胃线虫属 (Ostertagia)具有相似的作用。疾病血矛线虫病(haemonchosis)和奥斯 特塔格线虫病(ostertagiasis)特征在于浪费，所述浪费部分是由于与严重 感染相关的食欲缺乏引起。

相关的摄取血液的线虫，钩虫感染反刍动物、狗、猫、其它食肉动物、 和人。超过7亿人感染了钩虫，特别是美洲钩虫(Necator americanus)， 每年有700-900,000新病例，和50-60,000例由这些寄生虫的灾害引起的 死亡。

蠕虫寄生虫的控制目前主要依赖与牧场管理结合的抗蠕虫药的使用。 然而，这样的技术具有许多缺点----频繁的药物施用和牧场管理通常不切 实际，并且耐药性蠕虫品系变得愈加普遍。

从血矛线虫属获得的包含蛋白双联体H110D的提取物在注射给绵羊 时提供抗血矛线虫病的保护。该双联体H110D在血矛线虫属蠕虫的肠内 腔表面上发现。H110D的制备和应用已经在WO-A-88/00835中进行了描 述。

在WO-A-89/00163中，在寄生虫线虫蛇形毛圆线虫(Trichostrongylus colubriformis)幼虫中描述了这样一种蛋白，该蛋白在十二烷基硫酸钠聚 丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上具有41Kd的分子量。该蛋白从匀浆的 蛇形毛圆线虫(T.colubriformis)三阶段幼虫中提取。已经克隆了关于该 蛋白的基因。在捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)中发现了一种非 常相似的DNA序列，尽管尚未报道血矛线虫属蠕虫基因的体内表达。该 文献还报道了使用由重组生物体表达的抗原在绵羊中针对捻转血矛线虫 的接种试验的结果。在这些试验中，报告了在粪便中减少的卵数量，总体 上平均减少40％的卵数量。在接种后63天宰杀时，发现接种组绵羊含有 比对照组平均少52％的蠕虫。

EP0434909公开了具有抗凝活性的蛋白，其可以有效用作疫苗。在 WO9402169和WO9526402中公开了其它潜在有效用作疫苗候选物的蛋 白。

然而，对鉴定新的抗蠕虫药和/或开发针对这样的寄生虫的新型疫苗 存在紧急需求。

本发明的目的之一是提供用于开发新抗蠕虫药的肽或蛋白。提供用于 在反刍动物中提高免疫反应的肽或蛋白也是本发明的目的之一。

发明概述

本发明部分是基于本发明人鉴定和表征了一种在捻转血矛线虫中表 达的新型蛋白。本发明人已经鉴定了多种与所述蛋白相关的生理和酶活 性，开创了将所述蛋白用作治疗蠕虫且特别是血矛线虫属蠕虫感染的药物 靶标和疫苗候选物的可能性。

如在下文更详细地描述地，本发明人已经在变性条件下鉴定了蛋白的 表观分子量，约55KDa。基因组和蛋白质组研究表明，它包含来自捻转 血矛线虫(H.contortus)的2种高度同源的蛋白。所述蛋白表现出与秀丽 隐杆线虫(C.elegans)中的脯氨酰羧肽酶样蛋白的同源性，并且包括2 个丝氨酸羧肽酶S28型结构域。对该蛋白的生理学和酶学研究表明所述蛋 白具有显著的二肽基肽酶IV(DPP IV)活性和弱DPPII活性，并且能够延 迟血纤蛋白凝块形成。