[发明专利]内含来自ES细胞的造血前体细胞的结构物及使用该结构物的血细胞的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及内含由ES细胞制备的造血前体细胞的网状结构物(Endothelial Sac；embryonic stem-sac；ES-sac)。进而，本发明涉及使用该网状结构物的血细胞的制备方法。

背景技术

对于以白血病为代表的血液相关疾病的治疗，使必要量的血细胞稳定地扩增、供给，对于治疗是非常重要的，因此迄今为止由许多研究者尝试了造血干细胞或造血前体细胞的有效扩增的研究。在血细胞中，巨核细胞是使血小板前体细胞(proplatelet)进一步产生血小板的细胞，在治疗的应用中占有重要的位置。在血细胞中，血小板是血液凝固(止血)所必需的细胞，因此在白血病、骨髓移殖、抗癌治疗等中血小板的需求极高。迄今为止，一直采用由捐献者献血而获取的方法来供给血小板。然而，利用捐献者的方法由于长期的捐献者不足、无法冷冻所获取的血小板等，而难以实现稳定的血小板供给。另一方面，尝试了给予TPO的方法、由脐带血或骨髓细胞分化为巨核细胞的方法等，但是TPO的给予由于在给予后产生对TPO的抗体而使其无效，因而无法实用化。进而，采用由脐带血或骨髓细胞分化巨核细胞的方法也只能够得到极少数成为巨核细胞来源的造血干细胞，因此仍不是适于提供稳定的血小板的方法。

近年来，盛行在活体外使由活体只能少量得到的造血干细胞或造血前体细胞扩增的研究。例如，报道有由小鼠ES细胞建立能够自我复制、还能够分化成淋巴细胞的造血干细胞株的方法(专利文献1)；在活体外将灵长类动物的ES细胞分化诱导后，将得到的细胞移殖到羊子宫内的胚胎，由出生的羊胎儿获取灵长类的ES细胞的方法(专利文献2)；或者使维持造血干细胞未分化性的CD34阳性/CD38阴性细胞在活体外简便且稳定地扩增的方法(专利文献3)等。

为了稳定地供给血小板，使造血干细胞或造血前体细胞有效地分化成巨核细胞和血小板的方法是必需的。因此，盛行由源于各种动物的ES细胞诱导出巨核细胞、进而诱导出血小板的研究。Eto等人明确了通过将小鼠ES细胞与OP9基质细胞一起共培养从而分化诱导成巨核细胞(非专利文献1)；Fujimoto等人报道了采用与Eto等人同样的方法成功诱导出血小板(非专利文献2)。此外，还有由猴子的ES细胞成功分化诱导出巨核细胞的报道(非专利文献3)；有由人的ES细胞成功分化诱导出巨核细胞的报道(非专利文献4)。但是，无论哪种方法都没有确认血小板的释放。此外，为了稳定地获取除血小板、巨核细胞以外的血细胞在治疗上所必需的量，必须有效获取造血干细胞或造血前体细胞，但是该方法尚未能说确立。

专利文献1：特开2006-141356号公报

专利文献2：特开2004-380601号公报

专利文献3：特开2006-61106号公报

非专利文献1：Eto等，Proc.Acad.Sci.USA 2002；99：12819-12824.

非专利文献2：Fujimoto等，Blood 2003；102：4044-4051.

非专利文献3：Hiroyama等，Exp.Hematol.2006；34：760-769.

非专利文献4：Gaur等，J Thromb Haemost.2005；4：436-442.

发明内容

本发明人等鉴于上述情况对造血前体细胞的有效获取方法以及巨核细胞和血小板的获取方法进行了悉心研究，结果成功制备了造血前体细胞被浓缩而存在的网状结构物，进而，首次由人ES细胞成功制备了血小板，从而完成了本发明。

因此，本发明涉及内含造血前体细胞的网状结构物以及该网状结构物的制备方法。

进而，本发明涉及由该网状结构物有效地制备成熟巨核细胞、血小板等血细胞的方法。

在以往技术中，难以较高浓度地得到造血前体细胞，其结果是，血细胞的得到量也少。特别是难以由ES细胞诱导出血小板在治疗上可利用的量，对于人而言，连诱导都无法进行。发明人为了解决这些问题，着眼于在分化诱导ES细胞过程中得到的网状结构物，由该网状结构物进行了血细胞的诱导。

即，本发明涉及以下的(1)～(10)。

(1)本发明的第1方式是“一种内含造血前体细胞的网状结构物，其特征在于，是将ES细胞播种于饲养层细胞(feeder cell)上，在适于造血前体细胞分化诱导的条件下培养而得到的”。

(2)本发明的第2方式是“如上述(1)所述的网状结构物，其特征在于，所述适于造血前体细胞分化诱导的条件是在VEGF存在下培养14天～16天”。