[发明专利]基于鉴定羧基端肽分析蛋白质样品的方法

说明书

发明领域

本发明涉及使用质谱法同时分析蛋白质样品的方法，所述方法允许从 切割的蛋白质混合物选择性分离肽。本发明进一步涉及纯化肽的技术和质 谱数据的数据分析。

发明背景

在过去数十年，已经发展使用质谱法(MS)鉴定蛋白质的不同方法。在 所谓的指纹法中，蛋白质被分离并切割成肽片段。通过比较所产生肽的质 量和切割的蛋白质的计算机(in silico)数据库，可以鉴定母蛋白而无需进一步 测定序列。

然而，本发明的目的在于使用鸟枪法在单次试验中研究样品中存在的 不同蛋白质。常常通过选择性地分离含有内部半胱氨酸的肽来降低肽样品 的复杂度。因为半胱氨酸并不是存在于每一种蛋白质中，所以开发可选策 略来特异性地从产生的肽混合物中分离氨基端肽或羧基端肽。这样，每种 蛋白质由一个肽代表。例如，在US 6,156,527(Schmidt)和US2002/0106700 (Foote)中描述了基于分离羧基端肽的方法的实例。这种方法不允许基于鉴 定来源于相同蛋白质的不同肽的经典指纹法。然而，它的优点在于能够确 定地鉴定肽(并且因此鉴定其母蛋白(parent protein))，而没必要进行MS/MS 肽测序。

US6,846,679(Schmidt)披露了一种选择羧基端肽并将这些肽的质量与 羧基端肽的数据库进行比较的方法。该专利的实施例显示对于一组约1800 个羧基端Lys-C肽，仅对于约45％的这些肽，可以明确地将质量与产生的 Lys-C肽计算机数据库中的单一肽相关。

US2005/0092910(Geromanos)披露了一种确定在MS上肽的质量和该肽 的另一物理化学性质的方法。该方法允许区分具有相同质量的肽。然而， 考虑到分析完整样品的事实，仍然产生了具有相同质量及相同物理化学性 质的众多不同肽，从而这样的肽不能归因于单一母蛋白。

因此，仍然需要其中复杂蛋白质样品可以通过MS来分析而无需对 MS/MS上所产生的肽进行测序的高通量方法。

发明概述

本发明涉及基于切割蛋白质以及从其中分离和分析羧基端肽来分析蛋 白质(包括存在于复杂蛋白质混合物中的蛋白质)的方法。在本发明的方法 中，对分离的羧基端肽进行一个或多个肽纯化步骤并进行MS分析。在纯化 过程期间或其后，收集纯化的肽的物理化学性质而不是其质量。通过MS确 定纯化的羧基端肽的质量。基于与数据库的比较来鉴定肽，其中所述的数 据库合并有羧基端肽的质量和一种或多种物理化学特性。在具体实施方案 中，2种、3种、4种、5种或至多到10种额外物理化学特性用来注释该数据 库。本发明的方法允许以高精确度确定地鉴定羧基端肽(及因此其相应的母 蛋白)而无需在MS/MS上的从头测序。

选择羧基端肽的所述方法的优点在于每一种蛋白质在蛋白酶剪切后仅 由单一肽代表，从而引起待分析样品以及含有这些肽的信息的相应数据库 的复杂度大大降低。

所提出方法的另一个优点在于全部蛋白质的羧基端肽对于其基因组已 经测序的生物是已知的，如人、小鼠和大鼠，并且还有低等生物例如果蝇 (Drosophila)、秀丽隐杆线虫(C.elegans)和酵母。可以预测这些肽的精确分 子量，预计这会支持作为所测得质谱信号基础的所述肽的鉴定。这对于目 前可用的高效能质谱技术(如FT-ICR)尤其如此，该技术可以实现＞500,000 数量级的分辨率，并且可以达到＜1ppm的质量精确度。

此外，由于从基因组序列的计算机分析已知预期羧基端肽的性质，产 生合成肽文库并且可以确定制备过程期间每种肽的精确特性(例如在不同的 层析材料上的保留时间、在ESI/MALDI-TOF中的表现)，并进行比较以鉴定 来自所述复杂蛋白质混合物的肽。这显著地提高正确鉴定蛋白质的置信度。

本发明的又一优点在于羧基端肽在本发明的方法中保持未修饰状态(没 有蛋白质组学中常见并干扰通过质谱法对肽作下游分析的烷基化和乙酰 化)。因此，干扰使肽蒸发成气相的电离过程是不太可能的。

本发明方法的另一个优点是至少一部分的现存剪切变体，也即在蛋白 质氨基端侧出现的那些剪接变体，可以通过其中分离并鉴定了较不可变的 羧基端的本发明方法来定位。