[发明专利]修饰的麦草畏单加氧酶及其使用方法

说明书

发明背景

本申请要求2006年6月6日提交的美国临时专利申请序列号 60/811,152和2007年6月5日提交的美国专利申请序列号11/758,657的 优先权，将它们的公开完整引入本文作为参考。

1.发明领域

本发明一般涉及生物技术领域。更具体地，本发明涉及修饰的麦草 畏单加氧酶，其能够在转基因生物中赋予对除草剂麦草畏的耐受性。

2.相关领域描述

由于通过使用植物遗传工程技术引入性状如昆虫抗性和除草剂耐 受性，生产田间作物如玉米、大豆和棉花的方法在过去几十年中已经发 生了显著改变。这些改变已经导致每公顷更大的生产力、降低的生产成 本、生产方案中更大的灵活性和效率、杀虫剂使用减少，并且对于昆虫 抗性棉花的情况，农民健康得到改善。从而转基因作物被大量采用并且 现在生长于世界上的数百万英亩上。然而，为了使转基因作物在市场上 有持续的竞争力，需要增加新价值的性状。

尽管提高农作物和园艺作物的数量和质量的新的性状已经出现并 且将在以后的数年内继续增速出现，但是仍然需要改进食物、饲料和其 他产品生产方法的性状。例如，尽管当前可以得到耐受除草剂草甘膦、 溴苯腈、磺脲和其他除草剂处理的转基因植物，但是在所控制的杂草范 围和通过开发额外的除草剂耐受性作物可以解决的处理选择中存在空 白点。此外，耐受上述除草剂的杂草的出现(尽管通常是局部的和可变 的)造成了对额外或备选的杂草控制措施的需要。

尽管已经证明转基因除草剂耐受性在商业背景中是有价值的，但是 因此需要耐受其他除草剂的植物以避免过度依赖于任何单一除草剂和 增加管理难以控制的杂草种类的选项。尤其需要的是为得到环境友好的 并且在控制杂草方面高度有效的除草剂而开发除草剂耐受性。麦草畏是 有效且环境友好的除草剂的一个这样的例子，其已经被农民使用40多 年。麦草畏尤其可用于控制玉米、高粱、小米、牧草、干草、牧场、甘 蔗、芦笋、草皮和草籽作物中一年生和多年生阔叶杂草和几种窄叶杂草 (Crop Protection Reference，1995)。不幸的是，麦草畏可以伤害许多商业 作物和双子叶植物，如大豆、棉花、豌豆、马铃薯、向日葵和油菜，它 们对于甚至低水平的该除草剂也特别敏感。尽管如此，麦草畏在控制杂 草生长中给出有效并且从而是农业中的重要工具。

最近，从嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltophilia)分离了编码 麦草畏单加氧酶(DMO)的基因，其赋予对麦草畏的耐受性(美国专利号 7,022,896)。DMO参与将除草剂麦草畏(3，6-二氯-邻-茴香酸)转化为无毒 的3，6-二氯水杨酸。该基因在美国专利号7,022,896中公开为在表达 DMO基因的植物中提供对麦草畏的耐受性。然而，该基因的变体的开 发将有很大益处。此类变体可能在特定环境条件下具有改变的效率。以 这种方式，可以选择为特定环境优化的变体，在所述环境中，该变体将 意在被使用并且可以显示出尤其有益的动力学特征。该变体尤其可以在 不同的温度或pH条件下显示出最大效率，并且从而取决于细胞内条件 和/或预期的作物生长条件被选择用于特定的作物物种。

发明概述

一方面，本发明提供了分离的核酸序列，其选自：a)编码SEQ ID NO：1的多肽的核酸序列；b)包含SEQ ID NO：2的序列的核酸序列；和 c)编码与SEQ ID NO：1的多肽有至少90％序列同一性的多肽的核酸序 列，其中后一多肽具有麦草畏单加氧酶活性并且在对应于SEQ ID NO：1 的氨基酸112的位置包含半胱氨酸。在其他实施方案中，提供了DNA 载体，其包含可操作性连接于启动子的编码本文所述核酸的DMO。该 启动子可以在植物细胞中是有功能的。在一些实施方案中，编码麦草畏 单加氧酶的核酸序列可以可操作性连接于叶绿体转运肽。

另一方面，本发明提供了与SEQ ID NO：1有至少90％同一性的多肽 序列，其中该多肽具有麦草畏单加氧酶活性并且在对应于SEQ ID NO：1 的氨基酸112的位置包含半胱氨酸。