[发明专利]突变ILV5基因及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及突变乙酰羟酸还原异构酶基因(突变ILV5基因)及其用途， 特别涉及用于制造具有优良风味的酒精饮料的酿造酵母、使用该酵母制造的 酒精饮料、所述酒精饮料的制造方法等。

背景技术

Lager啤酒酿造由生成乙醇及风味化合物的一次发酵、及使啤酒风味物 质熟化的二次发酵(或储存期间(largring period))的2个发酵阶段组成。在 一次发酵中，酵母细胞生成分别为异亮氨酸及缬氨酸合成中的中间体α-乙酰 基-α-羟基丁酸及α-乙酰乳酸。这些乙酰羟酸的一部分向细胞外扩散，通过啤 酒中的非酶氧化脱羧，分别转变为2种连二酮(vicinal diketone，VDK)，即 2，3-戊二酮及双乙酰(参照图1)。VDK会带来如黄油味的不愉快味道，2，3- 戊二酮及双乙酰的阈值分别为0.9mg/L及0.15mg/L(非专利文献1：Meilgaard 1975，详细的引用文献如说明书的最后所记载)。

α-乙酰乳酸的自发脱羧是双乙酰生成的限速步骤。VDK量在储存期间降 低到允许水平。缩短啤酒熟化时所需的时间，可通过使用VDK生成量少的 酿造酵母菌株来实现。乙酰羟酸合酶(Ilv2p/Ilv6p)、乙酰羟酸还原异构酶 (Ilv5p)、二羟酸脱水酶(Ilv3p)及支链氨基酸氨基转移酶(Bat1p)/转氨 酶(Bat2p)催化异亮氨酸及缬氨酸合成的2个同类反应。

为构建VDK生成量少的酵母菌株，有使乙酰羟酸合酶失活及强化乙酰 羟酸还原异构酶活性的2种不同的研究方法。通过编码乙酰羟酸合酶的催化 亚基的ILV2基因的反义RNA的负控制，使酶活性减少超过80％，其结果， 使发酵中间点的双乙酰量降低40％(非专利文献2：Vakeria et al.1991)。

另一方面，编码乙酰羟酸还原异构酶的ILV5基因的数量对VDK生成产 生很大影响。用具有ILV5的多拷贝载体转化的酵母细胞与对照菌株相比， 显示出还原异构酶的活性增加了5～10倍，同时显示出双乙酰生成减少了50 ～60％(非专利文献3：Dillemans et al.1987；非专利文献4：Gjermansen et al. 1988)。已知参与异亮氨酸及缬氨酸合成的酶定位于线粒体基质中(非专利文 献5：Ryan及Kohlhaw 1974)。线粒体由2个亲水区(膜间隙及基质)、及2 个膜(外膜及内膜)组成(非专利文献6：Wiedemann et al.2003；非专利文 献7：Koehler 2004)。

线粒体因只合成8种由线粒体DNA编码的稳定的蛋白质，所以，达1000 种的线粒体蛋白质的大部分由核基因组编码，在细胞质中的游离型核糖体上 作为前体蛋白质合成后，借助于被称为TOM及TIM的蛋白质集合体[分别为 线粒体外膜及内膜的转位酶(非专利文献8：Endo et al.2003；非专利文献9： Truscot et al. 2003)]，被转运到线粒体膜内或跨膜转运。Ilv2p及Ilv5p在细 胞质中作为前体蛋白质被合成后，通过TOM及TIM23转位酶转运到线粒体 基质中。

N末端前序列在向线粒体基质移动时由线粒体的特异性加工肽酶切割 (非专利文献10：Gakh et al.2002)。N末端的47个残基作为Ilv5p可切割的 前序列而被鉴定(非专利文献11：Kassow 1992)。如Kassow所述，构建编 码转运肽的区域中具有缺失的ILV5基因，其构建物可影响双乙酰生成量。