[发明专利]用于获得抗原特异性B细胞的克隆群体的培养方法

权利要求书

1.一种鉴定表达抗原特异性抗体的B细胞的方法，所述方法包括：

(a)用抗原免疫兔宿主；

(b)从所述兔宿主收获B细胞；

(c)富集收获的B细胞以增加对所述抗原有特异性的B细胞的比 例，由此形成富集的B细胞群体；

(d)在包含EL4B细胞和活化的T细胞上清液的培养基中从所述富 集的B细胞群体中培养一个或多个细胞亚群体，从而产生克隆B细胞群 体；

(e)确定所述培养的亚群体是否产生对所述抗原有特异性的抗体， 由此鉴定一个或多个抗原阳性的亚群体；和

(f)确定个体B细胞通过下述方法是否产生对所述抗原有特异性 的抗体：

(i)从步骤(e)的一个或多个所述抗原阳性亚群体中分离一个或 多个个体B细胞；

(ii)提供固定的抗原，所述固定的抗原包括所述抗原与其直接或 间接连接的基质或固相支持物；

(iii)温育个体B细胞与所述固定的抗原；

(iv)检测由所述个体B细胞分泌的抗体是否与所述固定的抗原结 合；和

(v)鉴定表达对所述抗原有特异性的抗体的B细胞，该鉴定是通 过所述个体B细胞分泌的抗体与所述固定的抗原的结合来进行的，

其中所述的B细胞生成具有抗原亲和力的抗体，所述抗体具有的解 离常数(K_d)少于5×10^-10M^-1。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述固定的抗原包括装载抗 原的珠。

3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(f)(iv)包括温育所 述固定的抗原和与可检测的标记偶联的第二抗体，其中所述第二抗体为 结合步骤(b)的宿主的抗体的抗免疫球蛋白抗体。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述可检测的标记是荧光团。

5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)包括从至少一种选 自脾、淋巴结、骨髓和外周血单核细胞的来源收获B细胞。

6.根据权利要求1所述的方法，进一步包括分离或测序编码来自 所述个体B细胞的抗体链或其片段的核酸，所述个体B细胞在步骤(f) 中经确定产生对所述抗原有特异性的抗体，并在重组细胞中表达由所述 核酸编码的多肽。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述重组细胞是二倍体酵母。

8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)包括从所述免疫后 20天至90天或从所述免疫后50天至60天的宿主中收获B细胞。

9.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)之前所述宿主已 经自然地暴露于所述抗原。

10.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)包括使用与固相 基质或支持物直接或间接连接的抗原进行抗原特异性B细胞的亲和纯 化。

11.根据权利要求10所述的方法，其中与固相基质或支持物直接 或间接连接的抗原是生物素化的，并且经由链霉抗生物素蛋白、抗生物 素蛋白或中性抗生物素蛋白与所述基质或支持物连接。

12.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(d)的亚群体包含不 超过10,000个抗原特异性、抗体分泌细胞，或包含50至10,000个抗 原特异性、抗体分泌细胞，或包含50至5,000个抗原特异性、抗体分 泌细胞，或包含50至250个抗原特异性、抗体分泌细胞。

13.根据权利要求1所述的方法，其中培养步骤(d)的亚群体至 少3天。

14.根据权利要求1所述的方法，进一步包括确定所述培养的步骤 (d)的亚群体是否产生这样的抗体，所述抗体展现抗原与结合伴侣结 合的激动或拮抗作用、诱导或抑制特定靶细胞类型的增殖；诱导或抑制 靶细胞的溶解；或诱导或抑制包含所述抗原的生物途径。

15.根据权利要求1所述的方法，进一步包括确定由所述培养的步 骤(d)的亚群体产生的抗体的抗原结合亲和力。