[发明专利]使用经遗传工程改造的微观藻类、蓝细菌或细菌生产短链挥发烃类

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2006年6月29日提交的专利申请号为60/806,244的美 国临时申请的优先权，该申请以引用形式并入本文。

背景技术

已知有多种草本植物、落叶植物以及针叶植物具有合成短链类异戊二 烯(例如，异戊二烯(C₅H₈)和甲基丁烯醇(C₅H₁₀O₁))并将其释放到周围环 境中的遗传能力及酶促能力。这些短链类异戊二烯来自光合作用中早期的 卡尔文循环产物，并可以通过所谓的DXP-MEP途径在某种环境压力条件 下以可观速率在草本植物、落叶植物和针叶植物的叶绿体中合成。生物体 的热应激对在植物中诱导该过程特别重要，并且所得的烃类对大气的污染 已成为本领域现有技术所关注的焦点。

异戊二烯从草本植物、落叶植物和针叶植物中的释放是由于存在异戊 二烯合酶(IspS)基因，其是编码一种位于叶绿体中的蛋白质的核基因， 该蛋白质催化从二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)到异戊二烯的转化。如 上文所提到的，在叶绿体中从卡尔文循环的早期产物合成类异戊二烯(碳 固定和还原，参见图1)。五碳的类异戊二烯，例如，异戊二烯(C₅H₈)和 甲基丁烯醇(C₅H₁₀O₁)为相对小的疏水分子，其直接由二甲基烯丙基二 磷酸(DMAPP)合成(图2)。这些类异戊二烯为挥发性分子，很容易穿 过细胞膜并因此从叶释放到大气中。热应激-诱导以及植物释放短链烃的过 程已经作为有害的大气污染在文献中讨论过。尚未有从草本植物、落叶植 物和针叶植物的叶中大规模生产、收集和分离这些烃类的描述。

急切需要开发可有助于满足全球的能源需求同时不造成气候变化的可 再生生物燃料。本发明通过提供生产完全来自于阳光、二氧化碳(CO₂) 和水的挥发性短链烃的方法和组合物来应对该需求。这些烃可用作生物燃 料或合成化学工业中的原料。

发明概要

本发明部分地基于以下发现，即经过适当的改造可以利用微观藻类 (microalgae)、蓝细菌和原核生物光合作用生产五碳类异戊二烯(例如， 图3)。在植物和藻类中，DXP-MEP类异戊二烯生物合成途径是绝对需要 的，因为它导致许多必需长链细胞化合物的合成。单细胞绿藻在它们的叶 绿体中特异性的表达该途径，并利用相应的酶对多种分子(类胡萝卜素、 生育酚、植醇、甾醇、激素、以及其它许多分子)进行生物合成。本发明 涉及在生产和收集五碳挥发性类异戊二烯化合物(例如异戊二烯和甲基丁 烯醇)中使用经遗传改造的微观藻类、蓝细菌以及光合和非光合细菌的方 法和组合物。这些经遗传改造的生物可商业性地用于封闭的大规模培养系 统，例如，为内燃机或者在装载改造(on-board reformation)后为燃料电 池引擎提供可再生燃料的来源；或者为用于其它化学过程(如化学合成) 中的异戊二烯提供来源。

微观藻类、蓝细菌以及光合和非光合细菌不具有异戊二烯合酶或甲基 丁烯醇合酶的基因，所述两种酶分别催化异戊二烯(C₅H₈)和甲基丁烯醇 (C₅H₁₀O₁)生物合成的最后一步关键步骤。因此，本发明提供了遗传改 造微生物以表达异戊二烯合酶基因(例如调整过密码子的杨树异戊二烯合 酶基因)使所述生物可以生产异戊二烯(C₅H₈)的方法和组合物。

另一些方面，本发明还提供了用于遗传改造微观藻类、蓝细菌以及光 合和非光合细菌使其过表达类异戊二烯生物合成的第一关键步骤之内源 基因及其所编码蛋白质的方法和组合物。因此，本发明还包括在所述微生 物中提高天然Dxs和Dxr基因的表达，所述微生物例如绿藻如莱茵衣藻 (Chlamydomonas reinhardtii)；蓝细菌如集胞藻(Synechocystis sp.)；或 者光合细菌如深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)，或非光合细菌如大 肠杆菌(Escherichia coli)。Dxs和Dxr编码类异戊二烯生物合成中催化第 一关键步骤的酶。