[发明专利]普伐他汀的生产

说明书

技术领域

本发明涉及用于生产普伐他汀的一步发酵工艺。

背景技术

胆固醇和其它脂质在体液中由低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白 (HDL)转运。执行降低LDL-胆固醇机制的物质可以作为有效的抗高胆固醇 药剂，因为LDL水平与冠心病风险正相关。抑制素类的降胆固醇剂是医学 上非常重要的药物，因为它们通过抑制HMG-CoA还原酶降低血中的胆固 醇浓度。后一酶催化胆固醇生物合成中的限速步骤，即(3S)-羟基-3-甲基戊 二酰辅酶A(HMG-CoA)))到甲羟戊酸的转化。市场上存在若干种类 型的干扰素，其中阿托伐他汀(atorvastatin)、制甲羟酶素、洛伐他汀 (lovastatin)、辛伐他汀(simvastatin)和普伐他汀。阿托伐他汀通过化学合成 制造，而上文提到的其它干扰素或者通过直接发酵或者通过前体发酵生 产。这些(前体)发酵通过Penicillium、Aspergillus和Monascus属的真菌 进行。

普伐他汀(pravastatin)是通过两个连续的发酵生产的。首先 Penicillium citrinum生产制甲羟酶素，其内酯环被氢氧化钠化学水解；随 后将其补充至Streptomyces carbophilus培养物中，所述Streptomyces carbophilus将其羟基化为普伐他汀。使用不同的方法对生产这些代谢产物 的工业物种和方法进行最优化。藉此将Penicillium citrinum的工业制甲羟 酶素生产从原始的40mg/L提高至5g/L。对生物催化的转化而言， Metkinen获得了下述Streptomyces突变体菌株，其对具有80％转化率的3 g/L美伐他汀具有抗性(Metkinen News March 2000，Metkinen Oy，Finland； reviewed by Manzoni and Rollini，2002，Appl Microbiol Biotechnol 58：555- 564)。尽管这是有活力的商业方法但是其远非最优，因为与例如工业氨基 酸或青霉素G效价相比，制甲羟酶素效价相对较低。另外，制甲羟酶素需 要被稀释，否则其变得对生物转化中使用的Streptomyces菌株具有毒性 (Hosobuchi et al.，1983，J Antibiotics 36：887-891)，有并且20％的制甲羟酶 素补料不能被Streptomyces菌株转化。

作为上述问题的解决方案，若干份出版物描述了用于普伐他汀的一步 发酵工艺(WO 99/10499、US 6,274,360和EP 1,266,967)。然而，作为本 发明的部分，我们将展示出：解决该问题的所有这些建议是无效的并且需 要解决额外的问题，即制甲羟酶素到普伐他汀的细胞内转化。WO 99/10499描述了装备有编码p450酶的Streptomyces carbophilus基因的重组 体Penicillium citrinum菌株。而本文中显示，根据WO 99/10499构建的菌 株不生产普伐他汀，只生产制甲羟酶素。US 6,274,360描述了能够从 Actinomadura物种中分离的酶体系，所述酶体系可以将制甲羟酶素转化为 普伐他汀，还提出在异源物种中使用该酶体系生产普伐他汀。然而，因为 没有提供蛋白质或DNA序列，所以不可能验证这类权利要求。另外，这 类酶体系可能由不同的多肽组成和/或需要若干种宿主特异的氧化还原再生 酶或陪伴分子，这会阻碍该酶体系所有适当成员的纯化和分离。另外，如 上文所讨论的，即便是将已知的普伐他汀催化酶的DNA序列 (Streptomyces carbophilus p450-sca2基因)转移至制甲羟酶素生产者 Penicillium citrinum也不能导致普伐他汀形成。EP 1,266,967描述了 Aspergillus terreus和Monascus ruber的突变体菌株。尽管野生型菌株只生 产洛伐他汀，但是这些突变体被描述为生产洛伐他汀和/或普伐他汀。作为 本发明的部分，我们将证明根据EP 1,266,967的突变体菌株不生产普伐他 汀，而仅生产洛伐他汀。

因此，不能获得并且极度需要解决一步发酵法的问题的经济上可行的 方式。

发明概述