[发明专利]共价凝血因子Ⅶ-组织因子复合物

说明书

发明领域

本发明涉及凝血因子VII多肽和组织因子多肽的新颖共价复合物，尤其涉及具有功能活性并与相应的游离凝血因子VII多肽相比对凝血因子X的蛋白水解活性增强的复合物。该类复合物被认为特别适用于出血性疾病的治疗。 

发明背景 

生物活性增强的凝血因子VIIa多肽是治疗由于重组凝血因子VIIa的次优药效而使传统重组凝血因子VIIa疗法对其部分或完全不显疗效的不可控出血的有利分子。目前增强药效的方法反映了重组凝血因子VIIa的作用机制，即表现为不依赖于组织因子在活化的血小板上直接激活凝血因子X。 

组织因子是由263个氨基酸组成的完整膜糖蛋白受体，位于血管外膜细胞上。其由折叠成两个各被单个二硫键稳定化的致密III型纤连蛋白-样结构域(1-219)的胞外部分、一个跨膜片段(220-242)和一个短的胞质尾区(243-263)组成。它通过与凝血因子VII形成在血管损伤时可从血液循环中捕获的紧密Ca²⁺-依赖复合物作为凝血的关键抑制剂。组织因子也可以通过提供最优大分子外结合位点相互作用的支架和通过诱导凝血因子VIIa蛋白酶结构域的构象变化使正确定义活性位点区域从而大大增加对其生理学底物凝血因子IX和凝血因子X的蛋白水解活性。由直接蛋白质-蛋白质相互作用引起的TF对凝血因子FVIIa的构象激活可在体外通过提供含有组织因子可溶性外结构域(sTF)的凝血因子VIIa重现。 

Miyata等，生物化学(Biochemistry)，36，1997，5120-5127公开了一种重组凝血因子VIIa和可溶性组织因子通过同基双功能胺特异性 试剂的方式化学交联的共价复合物。但是该交联复合物并未表现出对凝血因子X的蛋白水解活性。 

发明概述 

本发明涉及凝血因子VII多肽和组织因子多肽的新颖共价复合物。该复合物与相应的游离凝血因子VII多肽相比对大分子底物凝血因子X表现出增强的蛋白水解活性。 

更具体而言，本发明涉及凝血因子VII多肽和组织因子多肽的共价复合物，其中凝血因子VII多肽和组织因子多肽通过(i)凝血因子VII多肽氨基酸和(ii)组织因子多肽氨基酸的组的氨基酸侧链之间的一个或多个指定连接的方式共价连接。 

而且，本发明也涉及凝血因子VIIa多肽和组织因子子多肽的共价复合物，其中凝血因子VIIa多肽和组织因子多肽通过(i)凝血因子VIIa多肽氨基酸和(ii)组织因子多肽氨基酸的组的氨基酸侧链之间的一个或多个连接的方式共价连接，其中经本文定义的体外蛋白水解检测测定，凝血因子VIIa的蛋白水解活性是游离天然(野生型)凝血因子VIIa的至少2倍，例如至少50倍，如至少100倍，例如至少200倍或至少250倍。 

本发明也涉及生产本文定义的凝血因子VII多肽和组织因子多肽复合物的方法，该方法包括a)用(i)包含编码该凝血因子VII多肽的核酸分子和与其操作性连接的表达控制区域的表达载体和(ii)包含编码组织因子多肽的核酸分子和与其操作性连接的表达控制区域的表达载体转染细胞，b)在表达凝血因子VIIa多肽和组织因子多肽的条件下培养已转染细胞，并c)通过适当方法分离已表达复合物。 

附图简述 

图1显示了凝血因子VIIa和可溶性组织因子共价复合物的模型，其包含可溶性组织因子V207C和凝血因子VIIa F40C之间的跨界面二硫化物。从V207C或F40C到天然(野生型)半胱氨酸残基跨越界面的C_α-距离显著大于7，这排除了两个分子间无意二硫化物对的 形成。 

图2分别显示了非还原和还原条件下天然(野生型)凝血因子VIIa(A泳道)和纯化的凝血因子VIIa F40C-sTF(1-219)V207C(B泳道)复合物的考马斯染色SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。HC和LC表示VIIa的重链和轻链。 

图3显示了野生型凝血因子VIIa(A泳道)、凝血因子VII Q64C和sTF(1-219)G109C瞬间共表达的条件培养基(B泳道)和纯化的凝血因子F40C-sTF(1-219)V207C复合物(C泳道)的免疫印记。 

发明详述 

本发明涉及凝血因子VII多肽和组织因子多肽的共价复合物，其中凝血因子VII多肽和组织因子多肽通过(i)凝血因子VII多肽氨基酸和(ii)组织因子多肽氨基酸的组的氨基酸侧链之间一个或多个指定连接的方式共价连接。