[发明专利]制备痘病毒的方法以及痘病毒组合物

说明书

技术领域

本发明涉及组合物和药物组合物，其包含痘病毒(poxvirus)，更特别的， 包含胞外包膜病毒。本发明还涉及制备痘病毒的方法和由此得到的痘病毒。 此外，本发明还涉及所述痘病毒和所述组合物在制备药物中的用途。

背景技术

新威胁(禽流感、西尼罗病毒、炭疽等)的出现和基因疗法的发展，使 得制备和纯化痘病毒用于预防或治疗目的的需求增加。对于哺乳动物病毒 安卡拉(Ankara)(MVA)而言尤为如此。此痘病毒最初用于给免疫缺陷的病 患接种预防天花，现在还作为载体用于基因疗法。例如，MVA作为MUC 1基因的载体，用于给病人接种，预防表达Muc1的肿瘤(Scholl等，2003， J Biomed Biotechnol.，2003，3，194-201)。携带HPV抗原编码基因的MVA， 还作为载体用于卵巢癌的治疗。

痘病毒是一群复杂的包膜病毒，主要以其罕见的形态、庞大的DNA 基因组和它们在细胞质复制的位置为特点。痘病毒科几个成员的基因组已 得到基因组图并测序，包括哥本哈根(Copenhagen)痘苗病毒(vaccinia virus)(VV)株(Goebel等人，1990，Virol.179，247-266和517-563；Johnson 等人，1993，Virol.196，381-401)和改良的痘苗病毒安卡拉(MVA)株(Antoine 等人，1998，Virol.244，365-396)。VV具有约192kb的双链DNA基因组， 编码约200个蛋白，其中约100个参与病毒组装。MVA为高度弱化的痘苗 病毒株，由痘苗病毒的安卡拉株在鸡胚成纤维细胞中超过500次连续传代 产生(Mayr等人，1975，Infection3，6-16)。MVA病毒保藏在法国微生物 保藏中心(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM))， 保藏号N⁶⁰²1-721。MVA基因组完整序列的测定和与哥本哈根VV基因组 的对比，使得能够精确鉴定病毒基因组中发生的变化、定义造成片段化 ORF(开放阅读框)的7个缺失(I到VII)和大量突变(Antoine等人，1998， Virology244，365-396)。

包膜病毒进入胞内的天然途径涉及一系列步骤，包括暴露在病毒表面 的病毒多肽与细胞受体的结合，以及病毒和细胞膜之间的融合机制，使得 病毒基因组释放进入感染细胞的细胞质。

然而，在痘病毒的特殊情况中，由于两种形态特殊的传染性病毒形式： 即称为胞内成熟病毒(IMV)和胞外包膜病毒(EEV)的两种病毒形式的存 在，准确的递送途径分析被复杂化了。IMV形式的特质之一以包围病毒核 心的单层脂包膜为特征，且尽管可在感染细胞裂解后胞外释放，仍主要处 于感染细胞的胞质内。许多暴露在IMV脂包膜表面的天然多肽已被鉴定， 例如p14kDa和p21kDa蛋白，分别由A27L基因(Rodriguez等人，1985， J.Virol.56，482-488；Rodriguez和Estaban，1987，J.Virol.61，3550-3554) 和A17L基因编码，以及由LtR、A14L、D8L、A9L(Yeh等人，2000，J. Virol.74，9701-9711)、E10R(Senkevich等人，2000，Virol.5，244-252) 和H3L基因编码的蛋白。与IMV相比，EEV形式具有额外的外层脂膜 包膜(双脂层)，由反面高尔基体网络潴泡得到。它相应于在感染细胞外释 放的病毒形式。EEV表面膜包膜具有IMV表面所没有的约10种蛋白，例 如编码的B5R、A34R和血凝素(HA)基因产物。对于大多数痘苗株(例如哥 本哈根和MVA株)以及其它痘病毒，例如禽痘病毒(Boulanger等人，2000， J.Gen.Virol.81，675-687)，均描述过所述IMV和EEV形式的共存。