[发明专利]DNA片段化分析

说明书

发明背景

在机能正常的生物系统中，细胞数目系藉由细胞增殖与细胞凋亡之间 的平衡得以调节。而细胞增殖与细胞凋亡之间的失衡则与许多疾病的病因 有关。例如，细胞凋亡机制的恶化被认为可促成神经变性疾病如阿尔茨海 默氏病、自身免疫病如多发性硬化症，以及与缺血相关的损伤如中风。反 之，适当细胞凋亡途径的减弱则被认为是某些疾病如癌症的成因机制。

细胞凋亡具有数种标志性特征，包括细胞皱缩与质膜起泡、染色质凝 聚、细胞核DNA片段化以及蛋白质降解。至少有两条不同的细胞凋亡途 径，即外源性途径与内源性途径(若欲阅读相关综述，请参阅Oncogene (癌基因)23：2861-2874，2004；Photochem.Photobiol.Sci.3：721-729， 2004)。外源性或受体介导途径系由死亡受体的配体例如肿瘤坏死因子所 诱导。死亡受体的配体藉由胱天蛋白酶级联机制传递信号，并最终引起胱 天蛋白酶激活的核酸酶对细胞核DNA的消化。内源性途径藉由线粒体机 制传递信号，并对环境中的应激原如紫外线或药物敏感。这些应激状况造 成线粒体膜通透性增加，从而导致细胞色素c、核酸内切酶G、凋亡诱导 因子(AIF)以及许多其它尚未鉴定的分子的释放。外源性途径或内源性 途径对细胞凋亡的相对作用取决于促细胞凋亡的因素与促进细胞存活的因 素之间的平衡。(若欲阅读相关综述，请参阅J.Intern.Med.258：479-517， 2005)。

细胞凋亡的诱导方式可有：死亡受体与配体的结合、细胞凋亡诱导物 的活化、胱天蛋白酶的活化、细胞存活分子的下调，或其它已知和未知的 新机制。所有这些方式均导致DNA片段化；因此，DNA片段化表型分析 将能鉴别出所有诱导细胞凋亡的化合物，而与其作用方式无关，并可能鉴 别出作用机制新奇的化合物。凝胶DNA梯型分析是分析DNA片段化的金 标准分析。然而，由于劳动强度高以及操作步骤多，凝胶DNA梯型分析 并不适合于高通量筛选。因此，需要有一种筛选分析方法，用以鉴别藉由 细胞凋亡经典途径以及新机制而起作用的因子。细胞毒性测定法具有应用 潜力，但这些测定法是非选择性的，因为它们所鉴定的化合物既涉及细胞 凋亡介导的细胞死亡，也涉及非细胞凋亡介导的细胞死亡，并且可以导致 显著的假阳性结果。因此，一种适合于高通量筛选的非放射性、稳健的分 析方法当属首选。

目前，已有三种不同形式的分析方法被用于筛选与细胞凋亡有关的化 合物。第一种形式基于一种放射性过滤方法。采用此法时，以3H-胸苷培 养细胞，然后用玻璃纤维过滤板将完整的DNA与片段化的DNA分开 (Anal.Biochem.242：187-196，1996)。该放射性分析法的通量受制于与大 剂量放射性相关的危险以及该法很高的劳动强度。第二种分析形式是 TUNEL分析，采用此法时，用转移酶将3’双链DNA(dsDNA)标上荧光 -dUTP标记，然后采用流式细胞术或图像分析法检测。有很多种TUNEL 分析试剂盒可供选用，但所有采用这些试剂盒的方法均很费事，而且每次 分析只能检测几个样品。第三种分析形式是夹心酶联免疫吸附测定 (ELISA)。此法采用了抗DNA抗体及抗组蛋白抗体。这种分析法也很 费事，而且由于需要两种抗体，此法对于高通量化合物筛选而言较为昂贵。

一种高效和非放射性分析形式将采用一种DNA嵌入剂如PicoGreen 或碘化丙锭来检测片段化的DNA。例如，PicoGreen是一种能潜入dsDNA 大沟的有机小分子。PicoGreen业已成为一种分析血样中DNA水平的有用 工具(Scan.J.Immunol.57：525-533，2003；Clin.Immunol.106：139-147， 2003；Blood 102(6)：2243-2250，2003)。采用DNA嵌入剂，本发明提供 了某些检测方法，可用于检测调节细胞内DNA片段化的物质，且适合于 高通量筛选应用。

附图简述

图1显示用喜树碱(campto)或DMSO(对照)处理后HL-60细胞 裂解液中PicoGreen荧光的变化，以相对荧光单位(RFU)表示(RFU， 相对荧光单位；DMSO，二甲基亚砜)。

图2显示用喜树碱(campto)处理后，HL-60细胞裂解液中PicoGreen 荧光信号(RFU，相对荧光单位)依赖于细胞裂解液中DNA水平(RFU， 相对荧光单位)。