[发明专利]类异戊二烯的生产

权利要求书

1.一种生产类异戊二烯的方法，包括：

(a)获得多个细菌或真菌宿主细胞，该宿主细胞包含编码用于生 成异戊烯焦磷酸的甲羟戊酸途径的一种或多种酶的异源核酸，其中所 有的途径酶的表达在至少一个异源转录调节物的控制下，其中所述甲 羟戊酸途径包括(i)将两个乙酰辅酶A分子组合以形成乙酰乙酰-CoA 的酶，(ii)缩合乙酰乙酰-CoA和乙酰-CoA以生成HMG-CoA的酶， (iii)将HMG-CoA转化为甲羟戊酸的酶，(iv)使甲羟戊酸磷酸化为甲 羟戊酸5-磷酸的酶，(v)将甲羟戊酸5-磷酸转化为甲羟戊酸5-焦磷酸 的酶，和(vi)将甲羟戊酸5-焦磷酸转化为异戊烯焦磷酸的酶；和

(b)在其中碳源受到限制以使得培养基提供75％或更低的细菌或 真菌宿主细胞最大比生长速率的培养基中培养所述细菌或真菌宿主细 胞。

2.权利要求1的方法，其中所述至少一种异源转录调节物是可诱 导的。

3.权利要求1的方法，其中所述甲羟戊酸途径酶在单个转录调节 物的控制下。

4.权利要求1的方法，其中所述甲羟戊酸途径酶在多个转录调节 物的控制下。

5.权利要求1的方法，其中所述宿主细胞包含编码甲羟戊酸途径 的所有酶的异源核酸。

6.权利要求1的方法，其中所述细菌宿主细胞是大肠杆菌。

7.权利要求1的方法，其中所述异源核酸包含编码来自具有内源 甲羟戊酸途径的真菌的甲羟戊酸途径酶的核酸序列。

8.权利要求1的方法，其中所述真菌宿主细胞是酿酒酵母。

9.权利要求1的方法，其中所述异源核酸包含编码来自具有内源 甲羟戊酸途径的原核生物的甲羟戊酸途径酶的核酸序列。

10.权利要求9的方法，其中所述原核生物是选自肠球菌属、假 单胞菌属和葡萄球菌属的属。

11.权利要求10的方法，其中所述异源核酸包含编码选自乙酰- CoA硫解酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶和甲羟戊酸激酶 的甲羟戊酸途径酶的核酸序列。

12.权利要求1的方法，其中所述异源核酸包含编码II类HMG 还原酶的核酸序列。

13.权利要求1的方法，其中所述宿主细胞在培养基中培养，其 中营养物和温度两者的水平保持低于提供该宿主细胞的最大比生长速 率的水平。

14.权利要求1的方法，其中培养基的温度至少比提供最大比生 长速率的温度低2℃。

15.权利要求14的方法，其中所述宿主细胞在至少比提供最大比 生长速率的温度低5℃的温度下培养。

16.权利要求14的方法，其中培养基的温度至少比提供最大比生 长速率的温度低10℃。

17.权利要求1的方法，其中所述培养基包含碳源且碳源的量提 供最大比生长速率的60％或更低。

18.权利要求1的方法，其中所述培养基包含碳源且碳源的量提 供最大比生长速率的50％或更低。

19.权利要求1的方法，其中所述培养基包含碳源且碳源的量提 供最大比生长速率的40％或更低。

20.权利要求1的方法，其中所述培养基包含碳源且碳源的量提 供最大比生长速率的25％或更低。

21.权利要求1的方法，其中所述培养基包含碳源且碳源的量提 供最大比生长速率的75％-10％。

22.权利要求1的方法，其中所述培养基是氮限制的。

23.权利要求1的方法，其中所述类异戊二烯以大于每升培养基 10克的量产生。

24.权利要求1的方法，其中所述类异戊二烯以高于每克细胞干 重50mg的量产生。