[发明专利]遗传编码的荧光香豆素氨基酸

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求以下申请的优先权：2006年5月23日提交的美国临时申请序 列号60/808,099；和2006年6月14日提交的美国临时申请序列号60/813,856； 两篇申请的内容通过引用全文纳入本文。

对联邦资助研发下所作发明的权利的声明

本发明在能源部合同号ER46051的政府支持下做出。政府对本发明享有 一定权利。

发明领域

本发明属于翻译生物化学领域。本发明涉及制备和利用正交(orthogonal) tRNA、正交氨酰-tRNA合成酶和它们的配对将非天然氨基酸掺入蛋白质的 组合物和方法。本发明还涉及用这种配对在细胞中产生蛋白质的方法以及 用这种方法产生的蛋白质。

发明背景

因为高度灵敏且操作安全，荧光已成为生物技术中最重要的检测信号之 一。诸如荧光共振能量转移(FRET)或荧光极化等方法能实时分析生物分子结合 情况、运动或构象改变。用荧光探针选择性修饰蛋白质的能力极其有助于蛋白 质结构和功能的体外和体内研究(Hermanson(1996)刊于Bioconjugate Techniques(生物偶联技术)，学术出版社(Academic Press)：圣迭戈；和Tsien (1998)Annu.Rev.Biochem.，67：509-544)。

目前体内研究蛋白质的荧光方法常依赖于含大荧光蛋白，例如绿色荧光蛋 白(GFP)的融合构建物。虽然已证实该探针可用于蛋白质表达、定位和生物分 子相互作用，但其尺寸大会导致明显的结构干扰。GFP融合还局限于靶蛋白的 C-或N-末端，并且对其环境相对不灵敏(Tsien(1998)Annu.Rev.Biochem.， 67：509-44)。GFP还需要许多转录物以获得合适的信号，其折叠和荧光团成 熟需要滞后时间。

还可采用化学方法用各种小的、合成的荧光团选择性修饰蛋白质从而尽可 能降低结构干扰(Hermanson，刊于Bioconjugate Techniques(生物偶联技术)， 学术出版社：圣迭戈(1996)；Martin等，Nat.Biotech.，23：1308-1314(2005)； Keppler等，Nat.Biotech.，21：86-89(2003)；Lin等，J.Am.Chem.Sci.， 128：4542-3(2006))。然而，这些技术通常局限于分离蛋白质上独特的反应性表 面可接近残基(例如，用马来酰亚胺衍生物修饰半胱氨酸；参见Hermanson， 刊于Bioconjugate Techniques(生物偶联技术)，(1996)，学术出版社：圣迭戈)， 表现出区域选择性不佳，具有细胞毒性或需要引入染料结合蛋白基序。

已在实验上证明可利用化学错酰化(misacylated)tRNA的生物合成标记方 法(Mendel等，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(1995)24：435-462；Hohsaka 等，FEBS Lett.(2004)560：173-177)，但蛋白质的产率有限而且通常只能在 体外进行。

直接在活生物体内将遗传编码的荧光氨基酸掺入蛋白质的确定位点可以 克服荧光标记蛋白质的许多局限性(Wang和Schultz，Angew.Chem.Int.Ed. (2005)44：34-66；Wang等，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.，(2006) 35：225-249)。位点特异性掺入荧光氨基酸能在宿主蛋白质中尽可能少地引入干 扰，还能以更高的精确度进行荧光共振能力转移(FRET)检测(Truong和Ikura， Curr.Opin.Struct.Bio.2001，11：573-578)。此外，利用荧光氨基酸能检测各 氨基酸位置的局部环境，通过改变蛋白质中荧光氨基酸的位置来查明介导与其 它细胞组分相互作用的残基。这对于研究蛋白质折叠也非常有用(Lakowicz， Principles of Fluorescence Spectroscopy(荧光光谱学原理)，第二版；Kluwer Academic/Plenum Publishers：纽约，1999)，特别是在单分子系统中(Lipman 等，Science(2003)301：1233-1235)，因为一个蛋白质分子通常含有多个色氨 酸残基而用荧光探针化学特异性标记蛋白质也成问题。