[发明专利]融合蛋白、其用途以及制备方法

说明书

发明背景

本发明参考了一些出版物。所有这些出版物的引用出处可直接在权利要求书部分之前找 到。据此本发明将参考的这些公开的出版物整合综述，以便更全面的描述本发明在本领域所 处的技术状态。

根据目前的免疫监督学说，免疫系统持续的识别和消除变异细胞。然而一些细胞能躲过 看似有效的免疫反应，结果发展成肿瘤(1-4)。大多数研究已证明了肿瘤逃脱免疫反应为大家 公认的现象，并由多种已提出的机制引起(1-4)。这些机制有：产生抑制性细胞因子，缺失免 疫优势肽，耐受杀伤机制(细胞凋亡)及缺失MHC I类分子(1-4)。这些逃脱机制其中之一显 示出与肿瘤发展密切相关，该机制是MHC I类分子缺失或下调。该逃脱机制普遍存在多数肿 瘤中，可起因于多种不同的突变。一些研究揭示了MHC I类分子荷载和递呈途径的薄弱环节， 包括β-2-微球蛋白缺失，TAP1/TAP2突变，LMP突变，MHC基因缺失杂合子，及特异性MHC 等位基因下调。

现有的癌症免疫治疗方法典型地采取免疫系统的两个部分：体液免疫系统和细胞免疫系 统。首先，全身注射高亲和性单克隆抗体(mAbs)可直接抑制细胞表面肿瘤相关抗原，并已证 明抗肿瘤活性具有显著的临床试验统计学意义(5，6)。此外，目前携带有效应子如细胞因子或 毒素的抗肿瘤mAbs正进行临床试验评价(7)。第二种关于特异性肿瘤免疫治疗的主要方法采 取免疫系统的细胞免疫系统，主要是所述CD8+细胞毒性T细胞。目前两个用于提高免疫系 统细胞免疫系统的抗肿瘤有效性的主要方法是：(i)给患者施用已知可被T淋巴细胞识别的肽 进行主动免疫，及(ii)过继性转移治疗即能够选择、激活及扩增高活性的T细胞亚群，从而改 善抗肿瘤作用。在第一个方法中，近来源自于已鉴定的肿瘤相关抗原(如gp100、MAGE家 族、NY-ESO-I)的MHC限制性肽已用于给患者预防接种。由于这些肿瘤特异性抗原源肽在 特定组织中特有的表达，因而它们具有高特异性(8-11)。第二方法，过继性细胞转移近来显示 出令人瞩目的结果，即从转移性黑素瘤患者分离出高选择性、抗肿瘤活性T细胞抑制过度表 达的自体分化抗原，进行体外扩增并再次给患者导入。在此方法中，人们已验证了T细胞的 持续克隆性再增殖、体内增殖、功能性活动及运送T细胞到肿瘤位点(12-14)。

最近提出了一种新的免疫治疗方法，其采用两个已公认的区域：(i)CD8+细胞毒性T细 胞消除递呈高致免疫MHC/肽复合物的细胞的已知有效性，和(ii)肿瘤特异的细胞表面抗原通 过抗体重组体片段，主要是单链抗体片段(scFvs)的靶向作用。该方法利用由两个功能不同的 实体组成的重组体融合蛋白：(i)携带高致免疫的肿瘤或病毒源肽的单链MHC I类分子，和(ii) 肿瘤特异的高亲和性scFv片段(15)。一些家族已显示生物素酰化的MHC肽通过与肿瘤特异 的抗体化学结合配对，在抗生物素蛋白链菌素或单体的HLA-A2/流行性感冒(Flu)基质肽复 合物上多聚化，可在体外诱导T淋巴细胞介导被包覆的肿瘤细胞溶解(16-20)。然而，这些方 法利用化学结合并使用全部的抗体或更大的片段，如Fab片段。然而，由于该结合方法的产 量和同质性以及肿瘤穿透能力因为所述分子的大体积而受到限制。Lev等描述了在单链重组 体HLA-A2和肿瘤特异性的scFvs之间产生的遗传融合物。这些融合物显示了体外体内均起 作用，可特异地诱导T淋巴细胞介导的体外和体内包覆靶点的肿瘤细胞溶解(15)。该新的嵌 合分子稳定性高度依赖于所述肽递呈于MHC的结合槽内。因此，当所述肽从所述嵌合分子 的scHLA-A2区域解离会降低其稳定性。Oved等通过构建新的嵌合分子提出了该问题，其中 所述肽通过短连接子与scHLA-A2/scFv结构连接。所述新的融合蛋白已测试其体外生物化学 活性和生物活性(21)。

广泛公认新的融合蛋白必须能保持其双重活性：通过所述具有亲和性的和间接有效的、 有效的及特异性细胞毒性的scFv部分与肿瘤靶细胞结合，及通过募集由共价键连接的 HLA-A2-限制性肽调节其特异性的C D8+T细胞与肿瘤靶细胞结合。

适当的免疫应答的MHC I类限制性CD8+细胞毒T细胞(CTL)效应子部分能很好的识别 肿瘤细胞为外来物，并开始级联反应最终致使肿瘤破坏。然而，肿瘤已经发展出复杂机制以 逃避免疫效应机制，研究最深入的是递呈由CTLs识别的抗原的MHC I类分子下调。