[发明专利]用于导入核酸、寡核酸或其衍生物的冷冻干燥体

说明书

技术领域

本发明涉及一种复合物的冷冻干燥体，其用于向细胞中导 入核酸、寡核酸或其衍生物，所述复合物含有核酸、寡核酸或 其衍生物，阳离子性聚合物或阳离子性脂质或含有其的集合体， 以及阴离子性聚合物；其制备方法和含有所述冷冻干燥体的核 酸、寡核酸或其衍生物的导入用制剂、试剂和试剂盒。

背景技术

现在，通过向细胞中导入目的基因、反义寡核酸、其衍生 物并表现该基因或功能，由此治疗先天性遗传病、癌细胞或 AIDS等的基因疗法、反义疗法正得到实用化，与此同时，还正 研究作为用于向细胞中导入基因(DNA)、反义寡核酸、其衍 生物的携带者即各种载体。

正在研究这种载体的其中一个、即一种安全性方面没有问 题、效率高、无免疫原性且容易制备的非病毒性载体，其为阳 离子性聚合物、阳离子性脂质体、阳离子性脂质等阳离子性物 质。

在使用这些阳离子性物质的方法中，由于DNA和阳离子性 物质的复合物带正电荷，因此由于与血细胞和白蛋白等血液成 分相互作用而凝集，从而成为导入细胞的障碍。为了解决这个 问题，现在正对下述方法进行研究：将核酸和阳离子性聚合物 的复合物用透明质酸衍生物包覆(专利文献1：日本特开2005 -176830号)；或者用具有含有羧基的侧链和含有糖残基的侧链 的聚乙二醇(PEG)包覆(专利文献2：日本特开2003-231748 号)；或者用具有游离羧酸侧基的PEG来防止复合物的凝集(非 专利文献1：J.Biomater.Sci.Polymer Edn.，Vol.14，No.6, pp.515-531(2003))这样的方法。

这样制备的DNA与阳离子性物质的复合物呈现出低凝集 性，而且在细胞中的基因表达也良好。但是，这种复合物由于 是不均匀的悬浮液，因此保存性低，需要在制备后立刻使用， 而且若以高浓度制备，就会发生凝集，因此存在浓度很难调整， 处理也复杂这样的缺点。而且，制备方面再现性也不好。

另一方面，在导入基因等物质时使用上述这样的DNA与 阳离子性物质的复合物时，对复合物大小(粒径)的控制也很 重要。这是因为给药到组织内或血流中时，随后的复合物的扩 散、向细胞的传递、吸收的效率对其药理效果有很大影响。但 是，一般来说，通过混合阳离子性聚合物这样的离子性高分子 进行复合物化时，容易导致高分子的凝集，形成非常大的颗粒 或纤维状的复合物。为了防止这样的情况，需要将进行混合的 溶液的浓度调整到极低。但是，由于用于基因导入等的制剂需 要某种程度以上的浓度，因此存在无法避免形成大的凝集块这 样的问题。而且，还考虑了在暂时混合稀的溶液、形成小复合 物后，进行浓缩的方法，但由于复合物颗粒迅速凝集，因此并 不是适当的浓缩手段。

因此，为了解决这些问题，还研究了可以容易地输送生物 制剂并提高储藏稳定性的一般方法即冷冻干燥法。但是，在对 核酸、寡核酸或其衍生物和聚阳离子性物质的复合物进行冷冻 干燥而得的物质中，确认了由于冷冻干燥而破坏了复合物的结 构，因此即使用于基因导入和寡核酸的导入中，也几乎不会表 现出作为基因或反义的功能(非专利文献2：J.Pharm.Sci.，vol 90，pp1445-1455(2001))。

作为解决这些问题的方法，提出了添加高浓度的单糖和二 糖等再进行冷冻干燥的方法(非专利文献3：Biochim Biophys Acta.2000 Sep 29；1468(1-2)：127-138.)。但是，这里所需 要的糖的量，按重量比为DNA的500倍至1000倍，我们认为再 水化后的溶液是比生理条件高出许多的高渗透压，因此并不实 用。而且，单糖和二糖自身也没有对基因表达有利的效果。而 且，为了减轻再水化后的渗透压，尝试利用中性多糖中的葡聚 糖(非专利文献4：J.Pharm.Sci.，vol94，pp1226-1236 (2005))。但是，高分子量的葡聚糖极大地抑制基因表达，而 且在使用低分子量(分子量3000左右)的葡聚糖时，为了防止 由于冷冻干燥而导致的凝集，需要按重量比添加DNA的100倍 以上的、相当高浓度的葡聚糖(非专利文献4：J.Pharm.Sci.，vol 94，pp1226-1236(2005))。这种冷冻干燥体在体内利用时， 为了获得需要的DNA浓度，需要在冷冻干燥后用少量的水或溶 剂再水化，进而再浓缩到高浓度。如果这样处理的话，则再水 化后的葡聚糖浓度会超过10％，而且冷冻干燥时的DNA浓度、 冷却温度等受到限制，在其实用方面的应用也困难。