[发明专利]通过实时聚合酶链反应探测和同时进行多重量化病原体的方法

说明书

技术领域

大体上讲，本发明涉及病原性细菌的检测、鉴定和量化，特别是，通过使用实时聚合酶链反应的多重扩增反应(multiplex amplification reaction)，来检测和多重、同时量化病原体的任何组合的方法，所述病原体如：李斯特菌(Listeria sp)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureusm)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)和/或大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)。 

发明背景 

目前，可通过食物传播的病原性细菌，如李斯特菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲杆菌以及大肠杆菌O157:H7的检测是医学界和公共卫生学界的一项非常重要的任务，而且在农业食品(agro-foodstuff)中也非常重要，无论是对食物产品(原材料和/或加工的产品)的生产商还是经销商，已经描述了对这些病原性细菌进行检测和鉴定的数种方法。 

被认为在检测、鉴定和量化病原体中最有效的现有方法之一是以分子技术为基础的方法，即聚合酶链反应方法，通常称为PCR。PCR程序通常被认为是用于特别地在给定的样品试验中，检测病原体核酸的最快并且最灵敏的方法，我们可以在Kary B.Mullis等人的以下同族美国专利的背景技术中找到关于所述PCR程序的描述：US-4,683,195、US-4,683,202、US-4,800,159、US-4,889,818、US-4,965,188、US-5,008,182、US-5,038,852、US-5,079,352、US-5,176,995、US-5,310,652、US-5,310,893、US-5,322,770、US-5,333,675、US-5,352,600、US-5,374,553、US-5,386,022、US-5,405,774、US-5,407,800、US-5,418,149、US-5,420,029以及其他专利。 

为了执行所述PCR技术，基本上来讲，您需要针对待鉴定的每种病原体的至少一对寡核苷酸，以便每对引物包括与毗邻(border)核酸靶的序列的5′末端的序列互补的第一核苷酸序列，和与毗邻核酸靶的序列的3′末端的序列互补的第二核苷酸序列。核苷酸序列应使每对寡核苷酸引物对于待检测的病原体是特异性的，以便它们不与其他病原体反应或退火。 

由于PCR技术是在个体基础上检测病原体的快速和灵敏的方法，因此这种技术也可以用于同时检测样品中存在的多种病原体。但是，使用PCR技术来同时检测一份样品中的多种病原体是困难的，因为其主要障碍在于，由于以同样存在的其他靶序列为代价来使用多种核苷酸序列优先扩增所述样品中存在的某些靶序列，而可能存在的退火反应。 

利用PCR技术对病原体进行多重和同时检测的实例参见John W.Czajka的国际专利申请WO-0314704的发布文本中描述的，以及参见Linxian Wo等人在以下同族美国专利中描述的：US-5,612,473、US-5,738,995、US-5,753,444、US-5,756,701和US-5,846,783。 

国际专利申请WO-0314704的公布文本描述了在一份复杂试验样品中特异性地和同时检测弯曲杆菌属(Campylobacter)的病原体物种的方法。待检测的弯曲杆菌属的病原体物种可以是空肠弯曲杆菌或大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)。所述复杂试验样品可以是食物样品、水样品，或者是多种食物(a rich array of food)。所述方法使用含或不含内部阳性对照和合适引物对的PCR扩增。可以在所述反应中检测多个物种。 

在同族的美国专利US-5,612,473、US-5,738,995、US-5,753,444、US-5,756,701和US-5,846,783中，描述了迅速和同时地检测一份样品中的传染原的多重PCR方法。所述被检测的传染原为：沙门氏菌(Salmonella spp)、志贺菌(Shigella spp)、弯曲杆菌、耶尔森氏菌(Yersinia spp)和大肠杆菌，特别是大肠杆菌O157:H7。这些专利中所叙述的方法的局限性在于，其允许在所述扩增过程中，寡核苷酸和探针之间，以及所述寡核苷酸与核酸的其他序列发生极小量的退火反应。