[发明专利]免疫学测定方法和芯片

说明书

技术领域

本发明涉及利用抗原抗体反应测定样品溶液中的特定成分的量的 免疫学测定方法，特别涉及适于在芯片上实施的免疫学测定方法。而 且，本发明涉及适于实施该免疫学测定方法的芯片。

背景技术

作为高精度地对活体样品(例如血液)中含有的过敏反应的起因 物质、病毒和细菌等蛋白质进行识别和定量分析的方法，免疫学测定 方法正受到注目。

免疫学测定方法大致分为免疫比浊法和免疫标记法。免疫比浊法， 是对抗原抗体反应产生的抗原抗体复合物引起的样品溶液的浊度变化 进行测定的方法。免疫标记法，是使用被标记物质标记的抗体，对抗 原抗体反应后的标记物质量的变化进行测定的方法。

免疫标记法按照标记物质的种类被细分。例如能够列举：使用放 射性同位素作为标记物质的放射免疫测定法，使用酶的酶免疫测定法 (EIA：enzyme immunoassay)，使用荧光体的荧光免疫测定法等。EIA 与其他免疫标记法相比，标记物质的安全性较高，能够简便的操作， 测定精度也高，因此被广泛使用。

作为代表性的EIA，例如是酶联免疫吸附测量法(Enzyme-linked Immunosorbent Assay：ELISA)。参照图1说明ELISA的一个例子。

(工序1-A：固相抗原的形成)

将含有捕获抗原的溶液导入反应腔室7内，其中，该捕获抗原具 有与测定对象抗原的抗原表位(epitope)相同的抗原表位，并且在规 定温度下保持规定时间，使该捕获抗原吸附于反应腔室7的表面。之 后，以不参与之后的抗原抗体反应和酶反应的蛋白质覆盖(屏蔽)吸 附的捕获抗原。由此，在反应腔室7的内部形成固相抗原6。固相抗原 6固定在反应腔室7的表面，不会被后述的洗涤从反应腔室7除去。

(工序1-B：测定对象抗原与抗体、以及固相抗原与抗体的结合反 应)

在样品溶液9中添加与测定对象抗原2特异性结合的抗体3。抗体 3处于被标记物质(例如酶)4标记的状态。之后，将含有该抗体3的 样品溶液9导入反应腔室7。由此，在反应腔室7中，固相抗原6与抗 体3之间、以及测定对象抗原2与抗体3之间进行抗原抗体反应。

(工序1-C：未反应的抗体和抗原抗体复合物的除去)

使用以Tris-HCL缓冲液为代表的洗涤液10，对反应腔室7的内部 进行洗涤。由此，从反应腔室7中除去抗原抗体复合物和未与固相抗 体6结合的抗体3，其中，该抗原抗体复合物是抗体3与测定对象抗原 2结合而形成的，固相抗原6和抗体3的结合物残留于反应腔室7内。

接着，对反应腔室7内残留的、固相抗原6和抗体3的结合物所 具有的标记物质4的量进行测定。该测定例如以下述方式进行。首先， 调制含有与标记物质4反应的测定用试剂(例如酶的基质)的溶液。 接着，通过将该溶液导入反应腔室7，在反应腔室7内得到含有固相抗 原6与抗体3的结合物和测定用试剂的测定溶液。在测定溶液中，使 测定用试剂和标记物质4进行反应后，对反映反应生成物的量的信号 进行检测。

样品溶液9中的测定对象抗原2的量，根据该测定的结果、固相 抗原6的量、和在工序1-B中导入反应腔室7内的样品溶液9的量而 被算出。

从使用微量的样品溶液，在短时间内测定样品溶液中的测定对象 物质的量的观点出发，芯片型的生物传感器受到注目。例如，日本特 开平2-062952号公报中公开了一种芯片型的生物传感器，该生物传感 器设置有：绝缘性基板，配置在基板上的电极系统，配置在电极系统 上的酶反应层，以及以露出电极系统和酶反应层的方式配置在基板上 的具有切口部的绝缘层。酶反应层含有由氧化还原酶和电子介质 (electron mediator)等代表的、用于诱导酶循环反应的测定用试剂。 作为氧化还原酶，使用以测定对象物质为基质的酶。例如，在测定葡 萄糖量的情况下使用葡萄糖氧化酶，此外，例如，在测定胆固醇量的 情况下，使用胆固醇氧化酶。该生物传感器，通过在切口部滴下样品 溶液，使测定用试剂溶解在样品溶液中，通过电子介质进行测定对象 物质和酶的反应(酶循环反应)。样品溶液中的测定对象物质的量根据 氧化电流值被计算出，该氧化电流值是通过使经酶反应而还原的电子 介质电化学氧化而得到的。