[发明专利]制备转化细胞的方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种将生物分子转移到细胞中的方法，一种特殊聚合物在将生 物分子转移到细胞中的应用，一种将生物分子转移到细胞中的试剂盒(kit)， 所述试剂盒在将生物分子转移到细胞中的应用，一种由生物分子和聚合物制备 的配合物，一种治疗剂组分，由生物分子和聚合物制备的配合物的应用，一种 通过基因疗法治疗疾病的聚合物，以及一种通过基因疗法治疗疾病的方法。

【背景技术】

已知现有技术中存在多种不同的将外源核酸--尤其是外源DNA--重组入 (转化或转染)细胞中的方法。对于活体内转化，主要采用两种方法：病毒介 导的基因转化和借助于阳离子脂质体或阳离子聚合物--如聚乙烯亚胺、聚L-赖 氨酸或、聚L-精氨酸--进行的转化。所采用的病毒载体包括腺病毒和逆转录酶 病毒，这些病毒可将非病毒DNA转染到能够进行有丝分裂的活性细胞中。阳 离子脂质体对DNA上带负电荷的磷酸盐骨架具有影响。

活体内转化的适当技术是磷酸钙共沉淀法(calcium phosphate precipitation)，该技术中，在氯化钙和磷酸钠的混合物中，将待转化的DNA绑 定到起沉淀作用的磷酸钙上，沉积的结晶体被添加到细胞培养基中，并通过内 噬作用被细胞吸收。除了该化学转化技术外，还已知有多种物理的活体内转化 技术，如显微注射，该技术采用注射器具直接将DNA注射到细胞核或细胞中， 如电穿孔法(electroporation)，该技术借助于电脉冲刺激细胞膜，而使得细胞 膜对DNA是可渗透的，再如所谓的基因枪法(particle gun technique)技术， 它是借助于在DNA上包覆细微的金属球而将外源DNA发射到细胞中。

上述活体内转化技术的一个特别不利情况是，这些技术往往是非常细胞特 异性的(cell-specific)。在磷酸钙共沉淀法中，转化过程更多地依赖于选择恰当 的含盐浓度，且对不同类型的细胞需要一定的实验技巧与经验。甚至，更重要 的是，现有技术中所描述的转化技术的不足之处在于，转化效率较高的转化试 剂一般具有较强的毒性，而那些毒性较低或是无毒的试剂的转化效率却又不能 令人满意。

作为一种备选，为了克服上述缺陷，阳离子聚合物被用于进行细胞的活体 内转化或转染。例如，众所周之的，DNA与聚乙烯亚胺(PEI)的配合可被成 功地用在将基因运送到细胞内((Boussif等，1995；Boussif等，1996；Abdallah等， 1996)。在这种情况下，通过细胞对配合物的随机绑定和吞噬来实现基因转移 (gene transfer)。象聚乙烯亚胺一样，碱性胺基酸的均聚物--如聚L-赖氨酸， 树枝状阳离子聚合物(dendritic cationic polymer)--如聚酰胺-胺 (polyamidoamines，简称PAMAM)、聚酰胺、聚丙烯胺、阳离子型甲基丙烯 酸、壳聚糖或D，L-丙交酯/乙交酯共聚物(poly(D，L-lactide-co-glycolide)，简称 PLGA)都可用作细胞转染的阳离子聚合物。对可用于细胞转染的阳离子的评 论由Holtorf和Mikos发表于“基于阳离子和非凝固性聚合物的基因转移”一文， 《核酸疗法药学展望》，2002(183)，第367-387页(″Cationic and non-condensing polymer-based gene delivery″，Pharmaceutical Perspectives of Nucleic Acid-Based Therapeutics，2002(183)，pages 367-387)。

这些现有技术中的已知阳离子聚合物的不足之处是要么其转染效率低，要 么虽然其具有较好的转染效率，但毒性却很强。此外，现有技术中已知的一些 聚合物，特别是树枝状聚合物，其合成成本是相当地高，例如，需要花费几周 的时间来合成42kDa的PAMAM树枝状聚合物(dendrimer)。

【发明内容】

本发明的一个目的是克服现有技术在细胞转化、特别是活体内转化中的上 述缺陷。

本发明进一步的目的是提供一种制备转化细胞的方法，该方法具有较高的 转化效率。另外，该方法尽可能地不使用细胞毒素助剂(cytotoxic auxiliaries)。