[发明专利]发光干细胞及其应用

权利要求书

1.能在有合适的生色团底物存在下，响应于细胞内钙浓度变化而表 达脱辅基发光蛋白且生成生物发光信号的稳定的重组干细胞。

2.根据权利要求1的稳定的重组干细胞，它是非人全能性或多能性 细胞；人或非人多能性肿瘤细胞或多能性细胞或其祖细胞，是胚胎、胎 盘或羊水来源的，或是成人来源的。

3.根据权利要求1或2的稳定的重组干细胞，其中所述脱辅基发光 蛋白基因是任意的脱辅基发光蛋白基因，是天然的或重组的或合成的来 源的。

4.根据权利要求3的稳定的重组干细胞，其中所述脱辅基发光蛋白 是天然的或诱变的突变体，其具有提高的发光活性和/或钙灵敏度。

5.根据权利要求3或4的稳定的重组干细胞，其中所述脱辅基发光 蛋白基因具有针对哺乳动物密码子选择优化的和/或融合至线粒体靶序 列上的序列。

6.根据前述权利要求中任一项的稳定的重组干细胞，其中所述脱辅 基发光蛋白序列是SEQ ID No.1。

7.根据前述权利要求1-5中任一项的稳定的重组干细胞，其中所述 脱辅基发光蛋白序列是在下述位置Gly₁₄₂→Cys诱变的Clytin序列 (GenBank登记号Q08121)。

8.根据前述权利要求1-5中任一项的稳定的重组干细胞，其中所述 脱辅基发光蛋白序列是在下述12个位置诱变的Clytin序列(GenBank登 记号Q08121)：Gly₅₈→Glu，Asp₆₉→Val，Ala₇₀→Cys，Lys₇₆→Arg，Lys₇₇→Gly，Ile₇₈-→Cys，Asp₈₁→Glu，Val₈₆→Ile，Glu₈₇→Ala，Ala₉₀→Gln， Val₉₂→Leu，和Glu₉₇→Gln。

9.根据前述权利要求中任一项的稳定的重组干细胞，其分化成特定 细胞谱系，以表达靶物。

10.根据权利要求9的稳定的重组干细胞，其中所述特定细胞谱系 是心肌细胞谱系或神经元谱系或间充质细胞谱系。

11.根据前述权利要求中任一项的稳定的重组干细胞，其中所述脱 辅基发光蛋白基因是在遍在的、器官-、组织-、细胞-或发育阶段-特异 性的或可诱导的启动子的控制下。

12.鉴别能刺激干细胞向特定细胞谱系分化的试剂的方法，其包含 下述步骤：

a)提供在未分化阶段的根据权利要求1-8的稳定的重组干细胞；

b)将所述细胞暴露于包含推定的分化诱导剂的化合物文库，以表达 至少一种特定细胞谱系靶物；

c)给细胞装载合适的生色团作为底物；

d)用配体刺激所述特定细胞谱系靶物，从而得到细胞内Ca⁺⁺的变化；

e)检测发光蛋白的生物发光。

13.根据权利要求12的方法，其中所述特定细胞谱系是心肌细胞谱 系或神经元谱系。

14.通过高通量筛选进行的根据权利要求12或13的方法。

15.鉴别抑制干细胞向特定细胞谱系的分化的试剂的方法，其包含 下述步骤：

a)提供在未分化阶段的根据权利要求1-8的稳定的重组干细胞；

b)将所述细胞暴露于包含推定的分化抑制剂的化合物文库；

c)将所述细胞暴露于已知的分化诱导剂，以表达至少一种特定细胞 谱系靶物；

d)给细胞装载合适的生色团作为底物；

e)用配体刺激所述特定细胞谱系靶物，从而得到细胞内Ca⁺⁺的变化；

f)检测发光蛋白的生物发光。