[实用新型]细菌革兰双检实时荧光定量PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本实用新型属生物技术领域，涉及定量PCR检测试剂盒，具体涉及一种双探针实时荧光定量PCR检测细菌性感染患儿血液、脑脊液、胸水、腹水等样本中细菌革兰阴、阳性菌分型及实时定量的方法。

背景技术

败血症是指细菌进入血循环，并在其中生长繁殖、产生毒素而引起的全身性严重感染的疾病。儿童特别是新生儿由于自身抵抗力差、皮肤薄嫩、出生后脐部未愈合等均易患败血症。小儿败血症如果不能早期诊断，及时、彻底地治疗，可致化脓性脑膜炎发生，影响小儿智力发育，导致儿童伤残和死亡。儿童败血症缺乏特异性临床症状及早期可靠的实验室指标，早期诊断十分困难。目前已有多种实验室方法应用于儿童败血症的诊断中，如血培养、血常规、C反应蛋白、病灶分泌物培养及涂片、病原菌抗原检测以及限制性内切酶分析(RFLP)等方法。但是由于上述方法费时、阳性率低，易污染，且有些指标非特异性，难以对儿童败血症做出迅速、准确的判断。

随着分子生物学技术的飞速发展及其在医学研究中的广泛应用，特别是最近几年兴起的荧光定量PCR技术，该方法具有准确性高、重现性好等特点，已广泛用于基因表达研究、病原体检测、SNP分析及基因分型等诸多领域。该方法采用完全闭管检测，省去了对PCR产物后处理，避免了交叉污染，结果判断由计算机完成，简化了操作步骤，并加强了结果的可靠性。随着荧光定量技术、仪器以及材料科学的发展，荧光定量技术不仅仅在定量上发挥它的优势，而且运用TaqMan或TaqMan-MGB探针的5`末端标记上不同的荧光染料(FAM、HEX等)技术可以进行基因分型、基因突变检测和SNP分析等方面研究。因此，利用双(多)通道荧光定量PCR仪，进行实时细菌革兰阴、阳性菌分型、定量的双检测临床应用成为可能。

16SrRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列。16SrRNA编码基因以多拷贝形式存在于所有细菌染色体基因组中，每个细菌约含5～10个拷贝，这使得对该基因的检测具有敏感性。16SrRNA编码基因内部结构由可变区和保守区组成。保守区为所有细菌所共有，有“分子化石”之称。可根据保守区设计各种细菌的通用引物，也可根据可变区设计细菌的革兰阴、阳性特异分型探针，用于细菌革兰阴阳性分型，目前几乎所有病原菌的16SrRNA基因测序已完成。因此16SrRMA基因已成为较理想的细菌基因分类的靶序列，逐渐成为细菌鉴别、分类的金标准。

运用实时荧光定量PCR技术，采用通用引物和革兰阴、阳性双特异荧光探针，开发研制用于细菌革兰阴、阳性菌分型及定量双检测试剂盒。并通过对临床上疑似细菌性感染的患儿外周血等标本的检测，旨在为临床败血症及化脓性脑膜炎等细菌性感染疾病的早期病原体诊断提供依据。以便早期及时制定治疗方案，减少死亡率及后遗症。

发明内容

本实用新型的目的是提供一种细菌革兰双检实时荧光定量PCR检测试剂盒，包含：定量PCR反应液、标准品、对照品、细菌DNA抽提裂解液，其中定量PCR反应液单管分装，矩阵排列，标准品为革兰阳性和革兰阴性标准品，对照品为阳性和阴性对照品。

其中细菌DNA抽提裂解液含有10mmol/L Tri-HCl、pH 7.65mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)；定量PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs、细菌通用引物、革兰阳性荧光探针、革兰阴性荧光探针、耐热DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)。细菌DNA抽提裂解液和定量PCR反应液必须用0.22μm膜过滤预处理。

检测用引物分上游引物和下游引物：

上游引物序列为：5`-CAACGCGAAGAACCTTACC-3`

下游引物序列为：5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′。

革兰阳性探针为：5`-FAM-ACGACAACCATGCACCACCTG-TAMRA-3`

革兰阴性探针为：5`-HEX-CAACATTTCACAACACGAGCTG-TAMRA-3`

革兰阳性标准品序列为：

CAACGCGAAG AACCTTACCA AATCTTGACA TCCTTTGACA ACTCTAGAGA

TAGAGCCTTC CTCTTCGGGG GACAAAGTGA CAGGTGGTGC ATGGTTGTCG

TCAGCTCGTG TCGTGAGATG TTGGGTTAAG TCCCGCAACG AGCGCAACCC