[发明专利]利用骨髓间充质干细胞诱导获得神经前体细胞的方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种利用骨髓间充质干细胞诱导获得神经前体细胞的方法。

(二)背景技术

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)除参与构成支持造血的微环境外，还具有强大的自我复制能力和多向分化潜能，不同的体外诱导条件可以决定其分化方向，可能是这些诱导条件启动了决定分化方向的转录因子。而将MSCs通过静脉途径或局部注射移植到体内不同的组织时，即可在相应的组织内分化形成该类组织细胞。长期以来神经系统损伤后神经细胞的再生移植困扰着人们，胚胎神经干细胞移植可促进神经损功能的恢复，但因伦理问题限制了其应用。MSCs具有来源丰富，不涉及伦理问题等优点，可能为神经系统疾病的治疗提供新途径。

尽管目前已有报道MSCs具有向神经细胞分化的潜能，但诱导体系仍需要改善，系统重复性较差或者细胞诱导后活性不良，最终不能获得功能细胞。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种系统重复性好的利用骨髓间充质干细胞诱导获得神经前体细胞的方法。

本发明采用的技术方案是：

一种利用骨髓间充质干细胞诱导获得神经前体细胞的方法，所述方法是将分离提纯的骨髓间充质干细胞经传代培养，取稳定传代的骨髓间充质干细胞转入诱导培养基，诱导培养7～20天，获得神经前体细胞；所述的诱导培养基为添加有生长因子的基础培养基，所述生长因子主要包括表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、神经营养因子3(NT-3)，添加量为：EGF 10～30ng/mL基础培养基，bFGF 5～20ng/mL基础培养基，IGF-140～60ng/mL基础培养基，NT-310～30ng/mL基础培养基。

所述生长因子也可为表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、脑源性神经营养因子(BDNF)和神经营养因子3(NT-3)的组合，添加量为：EGF 10～30ng/mL基础培养基，bFGF 5～20ng/mL基础培养基，IGF-140～60ng/mL基础培养基，BDNF 10～30ng/mL基础培养基，NT-310～30ng/mL基础培养基。

骨髓间充质干细胞来源广泛，取材方便，不受医学伦理学和法律的制约；且骨髓间充质干细胞能抑制T淋巴细胞成熟和增殖，移植后具有逃避免疫排斥反应的特点。因此若骨髓间充质干细胞能被诱导分化神经前体细胞进一步转化为内耳毛细胞，将很好的解决干细胞移植治疗感音神经性耳聋的细胞来源问题。

本发明采用贴壁法提取骨髓间充质干细胞，体外培养纯化后，选取表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子3(NT-3)组合成不同的诱导条件，加入骨髓间充质干细胞基础培养液中，诱导骨髓间充质干细胞分化。在诱导过程中，观察细胞形态变化，并用免疫细胞化学方法检测神经前体细胞或神经元细胞特异抗原：nestin、P27是否在诱导后的细胞表达，从而鉴定骨髓间充质干细胞能否被诱导分化为神经前体细胞，试图为干细胞移植治疗感音神经性耳聋提供实验基础，并有较高先进性和重要临床意义。经筛选，EGF+bFGF+IGF-1+NT-3的组合或者EGF+IGF-1+bFGF+BDNF+NT-3的组合，被认为是骨髓间充质干细胞分化为神经前体细胞的最佳诱导分化条件。

所述诱导培养所用培养基为本领域常用于骨髓间充质干细胞诱导培养的基础培养基，本发明中，所述基础培养基为含2％优级胎牛血清和1％N2辅剂的低糖DMEM液。所述基础培养基具体配制方法为：每100mL低糖DMEM液，加入2g胎牛血清和1g N2辅剂。

本发明将所述骨髓间充质干细胞培养传代至第4代后，再添加生长因子进行诱导培养。实验发现，P6期后，部分细胞失去典型的长梭形细胞样，变宽大，呈三角形，多边形，增殖速度开始变缓，传代间隔时间变长。2004年，Oswald等同样发现骨髓间充质干细胞在P6代后细胞逐渐变宽大，实验证实了这一结果。在传代过程中，干细胞可能在进行自发的分化，传代次数越多，越失去干细胞性。国外报道骨髓间充质干细胞可传代至30代以上，但此时干细胞特性值得怀疑。干细胞特性的维持可能与营养条件密切相关，同时需注意避免培养过程中理化因素对骨髓间充质干细胞的损害，如传代过程中，需注意控制胰酶消化时间，及注意吹打细胞时的轻柔。本发明只挑选P4代细胞作为处理细胞，因为此代细胞，干细胞特性维持良好，且已基本纯化。