[发明专利]猪疫苗使用的pIL-12基因佐剂及制备方法

权利要求书

1.一种猪疫苗使用的pIL-12基因佐剂，其特征在于：pIL-12包括两个亚基的编码基因p35和p40，p35编码基因大小为720bp，p40为1044bp，分别编码223个氨基酸和325个氨基酸的多肽。

2.一种猪疫苗使用的pIL-12基因佐剂的制备方法，其特征在于：从LPS活化的猪外周血单个核细胞(PBMC)提取总RNA，用RT-PCR方法扩增出pIL-12两个亚基的编码基因p35和p40，然后将p35基因和p40基因分别亚克隆到原核表达载体pET30c、pET30b中，克隆pIL-12基因。

3.如权利要求2所述的猪疫苗使用的pIL-12基因佐剂的制备方法，其特征在于：所述的RNA的提取过程为：从猪前腔静脉采血，然后用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)，用RPMI1640培养基进行培养，并加LPS于细胞培养液，分别取诱导2小时和12小时的细胞，用Trizol试剂盒提取总RNA。

4.如权利要求2所述的猪疫苗使用的pIL-12基因佐剂的制备方法，其特征在于：所述的RPMI1640培养基含有10U/ml青霉素、10U/ml链霉素和10％胎牛血清。

5.如权利要求2所述的猪疫苗使用的pIL-12基因佐剂的制备方法，其特征在于：所述的RT-PCR方法为：分别取诱导2小时和12小时的细胞所提取的总RNA，加入适量下游引物P2、P4，然后分别加入dNTP、10×buffer、RNasin、AMV反转录酶，再加入适量的Ex.Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，组成2个反转录扩增体系，合成p35和p40的PCR产物p35cDNA和p40cDNA。扩增结束后取5μL混合物，利用2％琼脂糖凝胶进行电泳。将p35和p40的PCR产物分别用BamHI和EcoRI酶切鉴定。

6.如权利要求5所述的猪疫苗使用的pIL-12基因佐剂的制备方法，其特征在于：所述的扩增体系包括p35扩增体系和p40扩增体系，p35扩增体系的反应条件为：预加热95℃5min，然后94℃ 1min，54℃ 1min，72℃ 1min，30个循环，最后72℃延伸10min；p40扩增体系及反应条件与p35相似，不同之处是退火温度为56℃。

7.如权利要求2所述的猪疫苗使用的pIL-12基因佐剂的制备方法，其特征在于：所述的克隆pIL-12基因的过程为：取SacI和SalI酶切处理的原核表达载体pET30c、pET30b和p35或p40的PCR产物，分别加入T4DNA连接酶和10×buffer，组成两个连接反应体系，16℃进行12小时连接反应，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，挑取阳性菌落，提取质粒。

8.如权利要求2所述的猪疫苗使用的pIL-12基因佐剂的制备方法，其特征在于：所述的克隆的鉴定为：将提取的质粒用PCR和SacI、SalI双酶切进行鉴定并筛选阳性克隆。